Produção de sonda de DNA diretamente biotinilada com N-hidroxisuccinimida biotina (BNHS)

Abstract

A utilização de sondas de DNA para análise genômica em fase sólida tem se expandido e ultrapassado as áreas da pesquisa, estendendo-se ao terreno do diagnóstico de rotina nas áreas de medicina humana e animal, bem como nas ciências forenses. Estas sondas têm sido utilizadas desde o surgimento da primeira técnica de hibridização descrita com o southern blotting, que envolve a imobilização, em filtros de papel, de fragmentos de DNA separados eletroforeticamente. Outra técnica descrita como o dot-hibridização é menos complexa do que o southern convencional por não requerer o passo prévio de eletroforese e por ser menos exigente quanto à qualidade do DNA, já que dispensa a digestão com enzima de restrição. A marcação mais comum para estas sondas é o fósforo radioisótopo (32P), que, apesar de sua alta sensibilidade, apresenta os inconvenientes de risco físico, necessidade de autorização para manipulação de radioisótopos, alto custo e uma vida média muito curta. Uma série de alternativas para o 32P têm sido utilizadas, com marcas diretas ou secundárias, entre elas a biotina, que tem mostrado grandes vantagens e tem sido usada também em laboratórios especializados e bem equipados. Este trabalho descreve uma modificação do método clássico descrito para sondas de DNA acopladas por biotina hidrazida. Utilizamos a N-hidroxisuccinimida biotina (BNHS) em dimetilformamida, para marcar resíduos de citosina disponíveis em segmentos de fita simples de DNA extraído de Corynebacterium pseudotuberculosis. A variação da proporção de biotina e de DNA, bem como sua especificidade e sensibilidade, foram cuidadosamente testadas e criteriosamente analisadas através de ensaios de hibridização, adsorvendo-se DNA cromossômico do C. pseudotuberculosis e outros DNAs em papel de nitrocelulose, seguindo-se a incubação com as sondas biotiniladas descritas, avidina-peroxidase e revelação com 4-cloro-1-naftol. Os resultados mostraram que a sonda de DNA produzida tem as características favoráveis esperadas. Desde que não é necessário o nick translation nem a utilização de material radioativo ou mesmo de hidrazida, sondas deste tipo podem ser utilizadas no auxílio do diagnóstico de infecções por C. pseudotuberculosis e outros microorganismos.