Combustíveis fósseis a exemplo do diesel estão sendo gradualmente substituídos por
biodiesel, uma fonte de energia renovável, considerada menos poluente, uma vez que a
maioria dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos carcinogênicos (HAP) são ausentes nas
emissões, que contêm menos monóxido e dióxido de carbono, assim como particulados.
Entretanto, sabe-se que o contato com a água pode reverter o processo de transesterificação do
biodiesel, liberando o metanol que é hepatotóxico. O aumento estimado da produção e uso do
biodiesel pode envolver riscos de acidentes e de contaminação de corpos de água. Avaliar a
toxicidade dessa fonte de energia sobre os organismos aquáticos é a finalidade deste trabalho
que estima e compara efeitos tóxicos em tilápias (Oreochromis niloticus) expostas às frações
solúveis em água (FSA) do biodiesel (B100) produzido por via metílica, da mistura
petrodiesel/biodiesel (B5 comercial), e do diesel, usando biomarcadores bioquímicos,
mutagênicos e histopatológicos. Os organismos-teste foram expostos à concentrações de 0
(controle) a 100% das FSA, por 24h. As atividades das enzimas β- Glucuronidase (EC
3.2.1.31), Aspartato aminotransferase/TGO (AST: EC 2.6.1.1) e da Alanina aminotransferase
TGP (ALT: EC 2.6.1.2) foram utilizadas como biomarcadores bioquímicos; o teste de
micronúcleos (MN) e anormalidades nucleares (AN), como biomarcadores de genotoxicidade
e o estudo histológico de brânquias e fígado, como biomarcadores histopatológicos. Amostras
de fígado foram homogeneizadas em solução de sacarose 0,25M, centrifugadas a 1500xg e as
avaliações enzimáticas foram realizadas no sobrenadante obtido. Amostras de fígado e
brânquias foram fixadas em Bouin, processadas histologicamente, coradas com hematoxilina
e eosina (H&E) e analisadas em microscópio de óptico. As mesmas amostras das FSA de B5
comercial e diesel foram analisadas por cromatografia gasosa para quantificação de
hidrocarbonetos e do B100, para o teor de metanol. No sangue, corado com Giemsa, foram
analisados MN e AN. As análises cromatográficas indicaram valores de BTX bem acima dos
limites permitidos por lei nas FSA dos petrocombustíveis e elevado teor de metanol, na FSA
do B100. Houve um aumento dose/resposta da atividade da enzima lisossômica βglucuronidase nos organismos expostos, em relação ao controle (valores médios significativos
nas concentrações de 46 e 100 % da FSA do B5 comercial e diesel, e de 100%, para o B100)
sugestivo de alteração na integridade da membrana lisossômica, induzida pelas substancias
tóxicas presentes nas FSA dos combustíveis testados. A análise estatística mostrou que houve
também um aumento de dose/dependência na atividade da enzima ALT entre as
concentrações dos três produtos testados; em todas as concentrações os valores médios foram
menores em B100, indicando este combustível com menos tóxico em comparação aos demais
testados. A atividade AST mostrou-se menos eficiente para o diagnóstico da
hepatotoxicidade. O teste MN mostrou que nas concentrações de 10 e 22% das FSA de B5
comercial e diesel, os valores médios foram mais elevados e significativamente diferentes do
controle e das demais concentrações testadas (p<0,05). Contudo, para o B100, esta diferença
significativa foi observada apenas em 22%, indicando que nestas concentrações as células
começaram a atingir o seu limite máximo de resposta em relação a formação de micronúcleos
(MN), seguido de um declínio nas concentrações mais elevadas (46 e 100%). No entanto, as
anormalidades nucleares (AN) aumentaram progressivamente, obedecendo a uma resposta de
dose/dependência, apresentando diferença significativa (p<0,05) nas concentrações de 46 e
100% de B5 comercial e diesel, e 100% de B100, quando comparadas ao controle e com as
demais concentrações. Entretanto, danos citogenotóxicos foram observados nos eritrócitos dos
peixes expostos às FSA dos três combustíveis testados. Os animais expostos apresentaram
alterações histológicas nas brânquias (aneurisma, edema, descolamento epitelial e fusão
lamelar) e danos no fígado (vacuolização, núcleos na periferia da célula, degeneração celular,
focos de necrose), refletindo assim a ação dos produtos na integridade desses tecidos e o
possível prejuízo de processos fundamentais para a manutenção da homeostase nesses peixes.
Apesar de apresentar efeitos menos severos que o diesel e B5 comercial, o B100 pode ativar
respostas bioquímicas, mutagênicas e histopatológicas, indicando que este combustível
também pode representar um risco para a biota aquática. Exceto a atividade da AST, todos as
técnicas utilizadas, mostraram-se como biomarcadores adequados ao monitoramento,
prevenção e controle de poluição por biocombustíveis.
Fossil diesel is gradually being replaced by biodiesel, a renewable biofuel, considered
as less pollutant. Most carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are absent in
biodiesel, which emissions are also lower in carbon monoxide, carbon dioxide and
particulates. However, the estimated increase in production and use of biodiesel may involve
risks of accidents and water bodies contamination; hidrolysis can reverse the biodiesel
transesterification process, and releases into water free methanol, which is toxic and
carcinogenic. The present work aims to estimate and compare the toxic effects of fuels on the
aquatic environment by exposing tilapia (Oreochromis niloticus) to the water soluble fraction
(WSF) of biodiesel (B100, resultant from methanol transesterification), the blend B5
petrodiesel / biodiesel (commercial), and diesel, by using biochemical, mutagenic and
histopathological biomarkers. The test-organisms were exposed to concentrations of 0
(control) to 100% of the water-soluble-fraction (WSF) of those fuels, for 24h. The activities
of the enzymes β-Glucuronidase (EC 3.2.1.31), Aspartate aminotransferase (AST: EC 2.6.1.1)
and Alanine aminotransferase SGPT (ALT: EC 2.6.1.2) were used as biochemical
biomarkers; the micronucleus test (MN) and the nuclear abnormalities (NA), as biomarkers of
genotoxicity and the histological alterations of gills and liver as histopathological biomarkers.
Liver samples were homogenized in 0.25 M sucrose solution, and centrifuged at 1500xg. The
resultant supernatants were used to assess the enzymatic activities. Liver and gills samples
were fixed in Bouin, histologically processed, stained by hematoxylin and eosin (H & E) and
examined under light microscope. The same WSF-samples of B5 and commercial diesel fuel
were analyzed by gas chromatography for quantification of hydrocarbons, and of B100, for
methanol content. Blood cells, stained with Giemsa were analyzed MN and AN. GC analysis
indicated BTX values well above the standard-limits in the petrodiesel-WSF and B5, and high
methanol content in the B100-WSF. There was an increased dose/response activity of the
lysosomal enzyme β-glucuronidase in exposed organisms, compared to control (significant
mean values at concentrations of 46 and 100% of the FSA's commercial B5 and diesel- WSF
and 100% for the B100-WSF), suggesting a possible change in the integrity of the lysosomal
membrane, induced by toxic substances present in the WSF. Statistical analysis showed that
there was also a dose/dependence increase in the ALT activity between the three products
tested; at all concentrations, the values were lower in B100, indicating this fuel as less toxic
compared to the others tested. AST activity was less efficient for the diagnosis of hepato-
toxicity. The MN test showed that at the concentrations of WSF-10 and 22%, B5 commercial
and diesel average values were higher and significantly different from control and from other
concentrations tested (p <0.05). However, for B100, the significant difference was observed
only in 22%, indicating that at this concentration the cells began to reach its maximum
response regarding the formation of micronuclei (MN), followed by a decline at higher
concentrations (46 and 100%). The nuclear changes (AN), however, increased progressively,
by following a dose/dependent response, presenting significant difference (p <0.05) at
concentrations of 46 and 100% of B5 and commercial diesel, and 100% of B100, when
compared to control and other concentrations. However, citogenotóxic damages were
observed in erythrocytes of fish exposed to the FSA of the three fuels tested. The animals
exhibited histological changes in the gills (aneurysm, edema, lamellar fusion and epithelial
detachment) and liver damage (vacuolization, nuclei at the periphery of the cell, cell
degeneration, necrosis foci), reflecting the action of the WSF- contaminants on the integrity of
these tissues and the possible loss of key processes for homeostasis maintenance. Despite
showing effects less severe than diesel and B5, B100 showed to be able to activate abnormal
biochemical, mutagenic and histopathological responses, indicating that this fuel can also
pose a risk to aquatic biota. Except for AST activity, all the used techniques proved to be
efficient as biomarkers for monitoring and pollution prevention and control.
