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Title: A depleção de colesterol interfere na expressão de caveolinas em linhagem celular de carcinoma epidermóide de boca
Authors: Cerqueira, Paloma Souza Gonçalves
???metadata.dc.contributor.advisor???: Xavier, Flávia Caló de Aquino
Keywords: Câncer de boca;Caveolina;Transição epitélio-mesenquimal;Adesão celular;Cultura celular.
Issue Date: 10-Apr-2020
Abstract: A cavéola é um microdomínio de membrana celular, rica em colesterol e esfingolipídios, constituída por proteínas estruturais e regulatórias denominadas de caveolinas (Cav-1, -2, e -3). Corresponde a um tipo de balsa lipídica e é um local de ancoramento de receptores celulares e moléculas envolvidas nas vias de transdução de sinal intracelular, inclusive em células neoplásicas. O desenvolvimento do câncer decorre da interrupção da homeostase entre a proliferação celular e apoptose, sendo tais células caracterizadas ainda pela elevada capacidade de invasão tecidual e metástase, evento este dependente do processo de transição epitélio-mesenquimal (TEM). Por meio deste, as células sofrem alterações em suas características epiteliais, adquirindo um fenótipo invasivo (mesenquimal). Dentre as moléculas sinalizadoras da TEM, a Cav-1 tem sido descrita, porém pouco se sabe da sua participação no câncer de boca, bem como em respeito a Cav-2 e Cav-3. Para avaliar a participação de caveolinas no carcinoma epidermóide de boca (CEB) e sua possível relação com a TEM, o presente estudo induziu a desestabilização da estrutura caveolar através do ensaio de depleção do colesterol em linhagem celular de CEB (SCC9). A expressão das Caveolinas 1 e 2 (Cav- 1 e Cav-2) foi avaliada pré e após ruptura da estrutura caveolar. As expressões gênica e proteica foram mensuradas através de qRT-PCR e Western blot, respectivamente, e a sublocalização celular avaliada através de imunofluorescência. A depleção do colesterol resultou em alteração da morfologia celular de CEB nas diferentes concentrações de MβCD, bem como diminuição das taxas de proliferação e viabilidade celular e aumento das taxas de apoptose tardia. A análise da expressão de transcritos de CAV-1 revelou a expressão gênica aumentada nas SCC9 tratadas no período de 24 horas em diferentes concentrações de MβCD: (5mM, 7,5mM, 10mM e 15mM) em relação SCC9 parental com diferença estatisticamente significativa (p= 0,0004, teste Kruskal-Wallis). Não houve diferença estatística para a mesma análise em CAV 2 (p= 0,1, teste Kruskal Wallis), assim como na análise de associação entre os transcritos CAV 1 e CAV2 (p= 0,88, teste de Mann-Whitney). A expressão proteica da Cav-1 mostrou-se aumentada, com posterior diminuição dose-dependente. Apenas nas amostras tratadas com MβCD a 5mM observou-se diferença estatisticamente significante (p= 0,02, teste Krukal-Wallis). O ensaio de imunofluorescência exibiu menor intensidade de marcação citoplasmática e membranar nas amostras tratadas, tanto para Cav-1, quanto para Cav-3. Tais achados indicam a modulação de colesterol como possível mecanismo subjacente à regulação dessas moléculas e ativação da TEM no CEB.
Caveola is a microdomain of cell membrane, rich in cholesterol and sphingolipídios, constituted by structural and regulatory proteins denominated caveolinas (Cav-1, -2, and -3). It corresponds to a lipid raft type and is an anchoring site of cellular receptors and molecules involved in intracellular signal transduction pathways, including cancerous cells. The development of cancer results from the interruption of homeostasis between cell proliferation and apoptosis. These cells are characterized by high tissue invasion capacity and metastasis, an event that is dependent on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process. Through this, the cells undergo changes in their epithelial characteristics, acquiring an invasive phenotype (mesenquimal). Among EMT participation in oral cancer, Cav-1 had been described, but litlle is known about it, as well as regarding Cav-2 and Cav-3. In order to evaluate the participation of caveolins in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and its relation to EMT, the present study induced destabilization of the caveolar structure through the cholesterol depletion assay in OSCC cell line (SCC9). The expression of Caveolins 1 and 2 was evaluated before and after rupture of the caveolar structure. Gene and protein expression were measured by qRT-PCR and Western blot, respectively, and cell sublocalization assessed by immunofluorescence. Cholesterol depletion resulted in alteration of OSCC cells morphology at different concentrations of MβCD., as well as decreased cell proliferation and viability rates. Analysis of CAV-1 transcript expression revealed increased gene expression in the treated SCC9, over the 24 hours period, at different concentrations of MβCD: 5 mM., 7.5mM, 10mM and 15mM, in relation to parental SCC9. The analysis of the CAV 1 gene expression presented a statistically significant difference (p = 0.0004, Kruskal-Wallis test). There was no statistical difference for the same analysis in CAV 2 expression (p = 0.1, Kruskal Wallis test), as well as for the association analysis between the CAV 1 and CAV2 transcripts (p = 0.88, Mann-Whitney test). Cav-1 protein expression was increased, with subsequent dose-dependent decrease. Only in samples treated with 5mM MβCD there was a statistically significant difference (p = 0.02, KrukalWallis test). The immunofluorescence assay showed lower cytoplasmic and membrane labeling intensity in the treated samples for both Cav-1 and Cav-3. These findings indicate the modulation of cholesterol as a possible mechanism underlying the regulation of these molecules and activation of EMT in OSCC.
URI: http://repositorio.ufba.br/ri/handle/ri/31815
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