Efeito neuroprotetor de extrato diclorometânico de sementes da Amburana cearensis em modelo de dano isquêmico e de excitotoxicidade glutamatérgica

Abstract

A excitotoxicidade glutamatérgica é um mecanismo fisiopatológico presente em muitas doenças neurodegenerativas crônicas (ex: Doença de Alzheimer) e agudas (ex: acidente vascular cerebral isquêmico – AVEI). Por ter alta densidade populacional de neurônios glutamatérgicos, uma das regiões afetadas neste processo é o hipocampo. Sob estas condições, neurônios e oligodendrócitos podem ser severamente afetados. No entanto, quando ativados, astrócitos podem atuar com agentes captadores de glutamato e atenuar ou impedir morte celular por esse mecanismo. Sabe-se que metabólitos secundários podem proteger desses danos excitotóxicos. Além disto, estudos apontam efeitos promissores relacionados à neuroproteção com extratos da Amburana cearensis em modelos in vitro, sendo a cumarina o agente potencial. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos neuroprotetores associados ao tratamento com Extrato Diclorometano da A. cearensis (EDAC). Para isto, dois modelos de AVEI no hipocampo foram utilizados: 1. Fatias de hipocampo de camundongos transgênicos (C57BL/6) (P10), nos quais a expressão da proteína de verde fluorescente (EGFP) é acionada por GFAP em astrócitos ou SOX-10 em oligodendrócitos, submetidas ao pré-tratamento com EDAC por 1 h e depois para condições normais (OGN) ou privação de oxigênio e glicose (OGD) por 1 h na presença ou ausência de EDAC. 2. Culturas organotípicas de fatias de hipocampo (COH) de ratos Wistar do tipo selvagem (P6-8) ou camundongos transgênicos (C57BL/6) GFAP-EGFP tratadas com glutamato e/ou EDAC. Três camadas do cornu ammonis 1 das fatias foram analisadas por imunohistoquímica para anticorpo anti-NeuN, anti-GLT1, anti-GLAST ou anti-GS. A expressão das proteínas foi avaliada por intensidade de fluorescência ou contagem de ramificações ou de células com ramificações de imagens obtidas via microscopia confocal. Os níveis de mRNA de genes de transcrição relacionados à proteção e sobrevivência neural foram avaliados por RT-qPCR. A viabilidade celular foi analisada por captação de iodeto de propídio (intensidade de fluorescência). Nossos resultados mostraram que, em condição de OGD sem reperfusão e em todas 9 camadas avaliadas, o EDAC impediu a redução de processos celulares da expressão de SOX10, sem aumento na expressão de proteínas astrocitárias entre os grupos controle OGN e OGD. Contudo, o EDAC foi capaz de aumentar a expressão de GFAP em condições de OGD. Em COH, observamos que o excesso de glutamato induziu um aumento de morte celular e que esta foi inibida pelo tratamento com EDAC. No entanto, os dados mostram que, nestas condições, o EDAC não protege neurônios. Por outro lado, GFAP, GLT1, GLAST e GS foram superexpressos em culturas tratadas com EDAC sob excitotoxicidade glutamatérgica. Também observamos, por RT-qPCR, um leve aumento da transcrição em GDNF, GLT1, GS, NGF e OLIG2 em fatias de hipocampo tratadas com EDAC. Nossos resultados demonstram que o EDAC tem potencial efeito farmacológico em modelos de isquemia encefálica. Mais estudos precisam ser realizados para melhor elucidar os efeitos observados com o EDAC e quais são os mecanismos de ação do efeito neuroprotetor.

Glutamatergic excitotoxicity is a pathophysiological mechanism present in many chronic neurodegenerative diseases (eg, Alzheimer's disease) and acute (eg, ischemic stroke – IS). Due to its high population density of glutamatergic neurons, one of the regions affected in this process is the hippocampus. Under these conditions, neurons and oligodendrocytes can be severely affected. However, when activated, astrocytes can act as glutamate capturing agents and attenuate or prevent cell death through this mechanism. It is known that secondary metabolites can protect from these excitotoxic damages. Furthermore, studies point to promising effects related to neuroprotection with Amburana cearensis extracts in in vitro models, with coumarin being the potential agent. The aim of this work was to investigate whether there are neuroprotective effects associated with treatment with A. cearensis Dichloromethane Extract (EDAC) in models of ischemia. For this, IS models (normoxia/hypoxia – OGN/OGD – or glutamate excitotoxicity) in the hippocampus were used to evaluate markers for expression of oligodendrocyte, astrocytic or neuronal proteins, or cell viability in slices, or mRNA levels related to protection and neural survival by RT-qPCR. Our results showed that, under OGD condition without reperfusion, EDAC prevented the reduction of cellular processes of oligodendrocytes, without increase in astrocytic protein (GFAP) expression or morphological changes between OGN and OGD control groups. However, EDAC was able to increase morphological changes and GFAP expression under OGD conditions. In organotypic hippocampal culture, we observed that excess glutamate induced an increase in cell death and that this was inhibited by treatment with EDAC. However, the data show that, under these conditions, EDAC does not protect neurons. On the other hand, astrocytic proteins related to glutamate metabolism were overexpressed in cultures treated with EDAC under glutamatergic excitotoxicity. We also observed, by RT-qPCR, a mild increase in mRNA transcription related to neural protection and survival in hippocampal slices treated with EDAC. Our results demonstrate that EDAC has a potential pharmacological effect in brain ischemia 8 models. Complementary studies with EDAC or its components can help to deepen and explain the characterization of the effects observed in this work.