Infecção pelo HTLV-1 e progressão para HAM/TSP: contribuição de marcadores moleculares humanos e virais

Abstract

O vírus linfotrópico de células T humana do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus humano sexualmente transmissível, cujas principais manifestações clínicas são a Mielopatia Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) e a Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATLL). A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central que pode resultar na perda parcial dos movimentos dos membros inferiores. Embora muitos aspectos dos eventos que levam ao desenvolvimento de doença não estejam esclarecidos, a resposta imune do hospedeiro, principalmente a resposta celular desencadeada por células T CD8+ específicas, é reconhecida como um evento crucial. O objetivo desse trabalho é investigar marcadores moleculares no vírus e no hospedeiro que possam estar relacionaodos à manifestação de doença, principalmente a HAM/TSP. No Capítulo I, foi realizada a busca por marcadores virais, no que diz respeito à apresentação diferencial de epítopos, para os diferentes perfis clínicos. Para tanto, fizemos um levantamento (Genbank) de 46 genomas completos do HTLV-1, e separamos as regiões codificantes das proteínas Tax, HBZ, p12, gp21 e gp46. Tais regiões gênicas foram avaliadas quanto a presença de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e em seguida traduzidas para proteína. As variações moleculares foram representadas em sequências de AA que foram submetidas ao IEDB (Immune Epitope Database a Analysis Resource) para predição de epítopos lineares ligantes de moléculas de HLAI. Foi possível identificar 7 “alelos protéicos” para a proteína gp21, 23 para gp46, 20 para HBZ, 13 para a proteína Tax, e 15 para a proteína p12, todos distruídos entre indivíduos ASS, fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Esporádico) e ATLL. Na predição, foram identificados mais de 15.741 epítopos para p12, menor quantidade de epítopos preditos e mais de 50.000 para Tax, com a maior quantidade de epítopos preditos. A proteína p12 teve a maior proporção de epítopos específicos, também seguida pela proteína Tax. A proteína HBZ teve os menores percentuais em todas as faixas de especificidade. Os resultados encontrados para as proteínas estruturais gp46 e gp21 foram semelhantes. Não houve nenhuma especificidade/exclusividade dos alelos de HLA entre as proteínas, “alelos protéicos” e/ou perfis clínicos do hospedeiro. Cada proteína apresentou um alelo de HLA como sendo o mais frequente entre os “alelos protéicos”, não havendo similaridade nessa ocorrência. E por fim, o alelo de HLA*A 32:01 foi citado entre os mais frequentes em todas as proteínas, e as proteínas gp21 e HBZ apresentaram perfis semelhantes no que se refere à ocorrência dos alelos de HLA mais frequentes. O perfil clínico HAM/TSP foi o que apresentou o maior número de variações moleculares entre as proteínas estudadas: foram 42 “alelos protéicos” contra 19 de indivíduos com ATLL e 16 de indivíduos ASS (Não HAM/TSP). Os achados de afinidade revelaram que dos 9 epítopos que apresentaram diferenças na afinidade às moléculas de HLA, 6 deles estavam associados a indivíduos ATLL, 4 a indivíduos sHAM/TSP e 2 a indivíduos ASS. Concluimos não haver um perfil de apresentação de epítopos que esteja associado ao status clínico do hospedeiro, uma vez que houve grande semelhança quanto aos alelos de HLA e quanto à posição dos epítopos apresentados entre os “alelos protéicos”. No entanto, identificamos variações moleculares importantes na predição dos epítopos especialmente nos genomas de indivíduos com ATLL e HAM/TSP. No Capítulo II, buscamos por marcadores no hospedeiro, em um grupo de indivíduos (HAM/TSP e assintomáticos) (N=44) infectados. Para tanto, realizamos a determinação do Exoma através da Plataforma Illumina e utilizando um chip para 551.004 SNPs. A taxa total de genotipagem das amostras foi de 0,997001, com perda de 35.163 SNPs (~6%), identificadas 515.841 variantes. A determinação ancestral revelou uma proporcionalidade de contribuição genética mais marcante para a origem africana na população estudada. Observamos predominância de mulheres no grupo caso, como já foi documentado na literatura. A média de idade dos indivíduos infectados foi de 59 anos (27-89 anos), sendo que a carga proviral média destes é de 55.253,41/106 células. Dentre os SNPs identificados, quatro deles se destacaram quanto às frequências alélicas nos grupos caso e controle, e são eles: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C e rs376863_A. Após análise de regressão multivariada, ajustada para ancestralidade, apenas os SNPs “rs1265564” (p=7,2*10-4 ) e “rs376863” (p=1,25*10-3 ) se apresentam associados ao desfecho. O SNP rs1265564, foi identificado no gene que codifica para a proteína CUX-2 que está associada ao reparo de DNA oxidado por ação das espécies reativas do oxigênio produzidas nos neurônios. Os quatro SNPs iniciais mostram estar em desequilíbrio de ligação com outros SNPs, porém nenhum deles dos já descritos na literatura e citados neste trabalho. Sugerimos uma busca minuciosa dos SNPs indicados neste trabalho, bem como a associação de marcadores moleculares do hospedeiro com marcadores virais, como forma de entender o processo de infecção e manifestação de doença como resultado de uma integração complexa e bem sucedida.

Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a sexually transmitted human retrovirus. Its main clinical manifestations are HTLV-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP) and T-Cell Leukemia / Lymphoma of the Adult (ATLL). HAM/TSP is an inflammatory disorder of the central nervous system that can result in partial loss of lower limb movements. Although many events aspects that lead to the disease development are unclear, the host's immune response, especially the cellular response triggered by specific CD8+ T cells, is recognized as a crucial event. The objective of this work is to investigate molecular markers in the virus and in the host that may be related to the manifestation of the disease, mainly HAM/TSP. In Chapter I we have search for viral markers, with regard to the differential epitope presentation, for the different clinical profiles. We carried out a survey (Genbank) of 46 HTLV-1 complete genomes, and separated the coding regions of Tax, HBZ, p12, gp21 and gp46 proteins. Such gene regions were evaluated for the presence of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), and then translated. These molecular variations were represented in AA sequences that were submitted to the IEDB (Immune Epitope Database Analysis Resource) to predict linear epitopes linking HLA-I molecules. It was possible to identify 7 “protein alleles” for the gp21 protein, 23 for gp46, 20 for HBZ, 13 for the Tax protein, and 15 for the p12 protein, all distributed among individuals ASS, fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Sporadic) and ATLL. In prediction results, more than 15,741 epitopes were identified for p12, the lowest amount of predicted epitopes and more than 50,000 for Tax, with the highest amount of predicted epitopes. The p12 protein had the highest proportion of specific epitopes, also followed by the Tax protein. The HBZ protein had the lowest percentages in all specificity ranges. The results found for structural proteins gp46 and gp21 were similar. There was no specificity/exclusivity of HLA alleles among proteins, "protein alleles" and/or host clinical profiles. Each protein presented an HLA allele as being the most frequent among the “protein alleles”, with no similarity in this occurrence. Finally, the HLA * A 32:01 allele was cited as the most frequent in all proteins, and the gp21 and HBZ proteins showed similar profiles with regard to the occurrence of the most frequent HLA alleles. The HAM/TSP clinical profile showed the highest number of molecular variations among the studied proteins: there were 42 “protein alleles” against 19 of individuals with ATLL and 16 of ASS individuals (Non-HAM/TSP). The affinity findings revealed that 9 epitopes showed differences in affinity to HLA molecules, 6 of them were associated with ATLL individuals, 4 with sHAM/TSP individuals and 2 with ASS individuals. We conclude that there is no epitope presentation profile that is associated with the host clinical status, since there was great similarity in the HLA alleles and in the predicted epitopes positions among the “protein alleles”. However, we have identified important molecular variations in the epitopes prediction, especially in the genomes of individuals with ATLL and HAM/TSP. In Chapter II, we looked for markers in the host, in a group of infected individuals (HAM/TSP and asymptomatic) (N = 44). For this, we have performed the determination of Exoma through the Illumina Platform and using a chip for 551,004 SNPs. The overall samples genotyping rate was 0.997001, with a loss of 35,163 SNPs (~ 6%), identified 515,841 variants. The ancestral determination revealed a proportionality of genetic contribution more marked for the African origin in the studied population. We observed a predominance of women in the case group, as has already been documented in the literature. The average age of infected individuals was 59 years (27-89 years), with an average proviral load of 55,253.41/106 cells. Among the SNPs identified, four of them stood out regarding the allele frequencies in the case and control groups, and they are: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C and rs376863_A. After multivariate regression analysis, adjusted for ancestry, only the SNPs “rs1265564” (p = 7.2 * 10-4 ) and “rs376863” (p = 1.25 * 10-3 ) are associated with the outcome. The SNP rs1265564, was identified in the gene that codes for the CUX2 protein that is associated with the repair of oxidized DNA by the action of reactive oxygen species produced in neurons. The initial four SNPs show to be in linkage disequilibrium with other SNPs, but none of those already described in the literature and cited in this work. We suggest a thorough search for the SNPs indicated in this work, as well as the association of host molecular markers with viral markers, as a way of understanding the process of infection and disease manifestation as a result of a complex and successful integration.