Estudo do efeito da rutina em células neurais em modelo de excitotoxicidade glutamatérgica.

Abstract

A rutina é um dos compostos polifenólicos mais comuns descritos na literatura, com grande destaque no âmbito científico devido as suas inúmeras atividades farmacológicas de interesse à saúde humana, incluindo seu potencial neuroprotetor. No contexto das doenças neurodegenerativas, a excitotoxicidade glutamatérgica tem sido apontada como um importante mecanismo de morte neuronal associado a progressão dessas doenças. Portanto, este estudo teve como objetivo investigar a atividade neuroprotetora da rutina para células neurais sob ação citotóxica do glutamato. Para isso, foram realizadas culturas organotípicas de cérebro, cultura primária de neurônio/células gliais mesencefálicas e cultura de células da linhagem PC12. A cultura de células PC12 foi submetida a diferentes tratamentos: tratamento direto com a rutina (0,5 – 50 μM) e/ou glutamato (10 - 60 mM); tratamento indireto obtido com o uso de meio condicionado da cultura organotípica cerebral de rato Wistar (p7-p9) tratados com a rutina (0,5 μM) e glutamato (60 mM). Em adição, também tratamos cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas com rutina a 0,5 μM. Passadas 24 h dos tratamentos direto e indireto das células PC12, realizamos as análises de viabilidade celular utilizando o Teste de de Iodeto de Propídio. Além disto, realizamos análises morfológicas após coloração de Rosenfeld para as células PC12 e para a cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas. Os resultados obtidos com o teste de viabilidade celular demonstraram que a rutina não foi tóxica para as células PC12 até a concentração de 10 μM, por 24 h. O glutamato, por sua vez, induziu efeito tóxico para as células PC12 de maneira concentração-dependente, sendo que a concentração a 60 mM foi capaz de provocar aproximadamente 100% de morte para as células em cultivo. Em relação aos ensaios de neuroproteção direta, demonstrou-se que a rutina não foi capaz de proteger as células PC12 contra a toxicidade do glutamato a 30 e 60 mM, sendo essas concentrações tóxicas para 20% e 100% de morte, respectivamente. Por outro lado, o meio condicionado de cultura organotípica tratada com a rutina (0,5 μM) + glutamato (60 mM) induziu baixa toxicidade para células PC12, mais especificamente apenas 8% das células morreram com o tratamento, enquanto que o tratamento direto apresentou 100% de células mortas. Em relação as alterações morfológicas, o tratamento indireto com meio condicionado de tratamento com rutina induziu mudanças características de diferenciação neuronal para aproximadamente 26% das células em cultivo, diferente do tratamento direto com rutina o qual induziu 2.5%. Estas alterações morfológicas relacionadas ao aumento de pontos de ramificações e ao aumento do comprimento de neuritos também foram observadas em células PC12 sob tratamento indireto e cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas. Estes resultados indicam um efeito neuroprotetor e morfogênico da rutina que podem estar associados à modulação do metabolismo do glutamato pelos astrócitos e/ ou liberação de fatores solúveis neuroprotetores e indutores de diferenciação neural.

Rutin is one of the most common used polyphenolic compounds described in the literature, with great scientific prominence due to its interesting pharmacological activities for of human health, including its neuroprotective potential. In the context of neurodegenerative diseases, glutamatergic excitotoxicity has been identified as an important mechanism of neuronal death associated with progression of these diseases. Therefore, this study aimed to investigate the rutin neuroprotective activity for neural cells under cytotoxic glutamate action. For this, organotypic cultures of the brain, primary culture of neuron/ mesencephalic glial cells and culture of cells of the PC12 strain were performed. The PC12 cells culture was subjected to different treatments: direct treatment with rutin (0.5 - 50 μM) and /or glutamate (10 - 60 mM); indirect treatment using conditioned medium obtained from brain organotypic culture of Wistar rats (p7-p9) treated with rutin (0.5 μM) and glutamate (60 mM). In addition, we also treated primary culture of mesencephalic neurons/glial cells with 0.5 μM rutin. After 24 hours of direct or indirect treatment of PC12 cells, we performed cell viability analyzes by Propidium Iodide test. In addition, we performed morphological analyzes after Rosenfeld staining for PC12 cells and for primary culture of mesencephalic neurons/glial cells. The results obtained with the cell viability test demonstrated that rutin was not toxic to PC12 cells 10 μM, for 24 h. Glutamate, in turn, induced a toxic effect in PC12 cells in a concentration-dependent manner, and the concentration at 60 mM was able to cause almost 100% of death to the cells in culture. In relation to direct neuroprotection assays, it was demonstrated that rutin was not able to protect PC12 cells against glutamate toxicity at 30 and 60 mM, these concentrations being toxic to 20% and 100% death, respectively. On the other hand, conditioned media from brain organotypic culture treated with rutin- (0.5 μM) + glutamate (60 mM) induced low toxicity in PC12 cultures, more specifically only 8% of cells died with treatment, whereas direct treatment presented 100% dead cells. Regarding morphological changes, indirect treatment with rutin induced a characteristic change in neuronal differentiation for approximately 26% of cells in culture, unlike direct treatment which induced 2.5%. These morphological changes related to the increase of branch points and the increase of neurite length were observed in PC12 cells and in primary culture of mesencephalic neurons/glial cells. These results indicate that the neuroprotective and morphogenic effects of rutin may be associated with modulation of glutamate metabolism by astrocytes and/ or release of soluble neuroprotective and inductors of neural differentiation factors.