Avaliação da resposta imune humoral a lipofosfoglicanos de Leishmania Infantum em cães com diferentes apresentações clínicas de leishmaniose visceral

Abstract

Este é o primeiro estudo sobre o uso de lipofosfoglicanos (LPG) de Leishmania infantum no diagnóstico da leishmaniose visceral (LV) em cães infectados e com diferentes apresentações clínicas da doença. A LV canina (LVC) é uma zoonose crônica, transmitida nas Américas por insetos vetores do gênero Lutzomyia, sendo a L. infantum a espécie isolada em cães infectados. A susceptibilidade ou resistência do cão ao desenvolvimento da doença clínica dependem da resposta imune desencadeada pelo parasito após a infecção. Os LPGs sãos moléculas que medeiam etapas metabólicas essenciais à virulência da Leishmania, tanto no vetor flebotomíneo quanto no hospedeiro mamífero. Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar o LPG como antígeno para imunodiagnóstico da LVC pelo teste ELISA indireto. Para padronização do ensaio ELISA-LPG, foram utilizadas 165 amostras de soro de cães, 97 positivos na análise molecular (PCR) de aspirado esplênico e infectados naturalmente por L. infantum e estadiados clínica e laboratorialmente em 10,3% (10/97) no estadio I, em 23,7% (23/97) no estadio II em 57,7% (56/96) no estadio III e em 8,2% (8/97) no estadio IV. Como controles negativos, foram utilizados 68 soros de cães de área não endêmica para LVC. As amostras de soro testadas pelo ELISA-LPG foram comparativamente testadas por ELISA indireto utilizando antígeno total lisado (ATL) de L. infantum (ELISA-ATL). O ELISA-LPG apresentou sensibilidade de 91,7%, especificidade de 98,5%, acurácia 99,7%, valor preditivo positivo (VPP) 98,8%, e valor preditivo negativo (VPN) 89,3%. Para verificação de reatividade cruzada nos ensaios ELISA-LPG e ELISA-ATL, foram utilizados soros de cães naturalmente infectados por Hepatozoon canis, Ehrlichia canis, Babesia vogeli canis, Anaplasma platys, Leishmania braziliensis e amostras de soro de cães infectados experimentalmente por Trypanosoma cruzi nas fases aguda e crônica. O teste ELISA-ATL, o qual teve 98,8% de especificidade e 85% de sensibilidade, apresentou reação cruzada para Ehrlichia canis e Babesia vogeli canis, enquanto que no ensaio ELISA-LPG não houve reação cruzada em soros de cães infectados com nenhum dos agentes testados. As amostras de soro de nove em 10 cães sem sinais clínicos, classificados no estadio I da LVC, foram positivas no ELISA-LPG, enquanto o ELISA-ATL não apresentou sororreatividade para nenhuma dessas amostras. O ELISA-LPG apresentou também maior intensidade de reatividade em amostras de soro de cães no estadio II da LVC, quando comparado ao ELISA-ATL. Conclui-se que o LPG de superfície de L. infantum foi reconhecido por soros de cães infectados e demonstrou ser uma ferramenta com alto poder de detecção de cães sem sinais clínicos. Os resultados permitem recomendar a aplicação do ELISA-LPG para o diagnóstico sorológico de LVC.

This is the first study on the use of lipofosfoglicanos (LPG) of Leishmania infantum in the diagnosis of visceral leishmaniasis (VL) in infected dogs and with different clinical presentations of the disease. Canine VL (CVL) is a chronic zoonosis, transmitted in the Americas by insects vectors of the genus Lutzomyia, with L. infantum being the isolated species in infected dogs. The susceptibility or resistance of the dog to the development of clinical disease depends on the immune response triggered by the parasite after infection. LPGs are molecules that mediate metabolic steps essential to the virulence of Leishmania, both in the phlebotomine vector and in the mammalian host. Therefore, the aim of this study was to evaluate LPG as an antigen for the immunodiagnosis of CVL by the indirect ELISA. For the standardization of the LPG -ELISA assay, 165 serum samples from dogs were used. 97 positives in the molecular analysis (PCR) of splenic aspirate and infected naturally by L. infantum were staged clinically and laboratorially in 10.3% (10/97) in stage I, in 23.7% (23/97) in stage II in 57.7% (56/96) in stage III And 8.2% (8/97) in stage IV. As negative controls, 68 sera of dogs of non-endemic area for LVC were used. Serum samples tested by the LPG-ELISA were comparatively tested by indirect ELISA using lysed total antigen (TLA) from L. infantum (TLA-ELISA). The LPG-ELISA presented sensitivity of 91.7%, specificity of 98.5%, accuracy 99.7%, positive predictive value (PPV) 98.8%, and negative predictive value (NPV) 89.3%. To verify cross-reactivity in LPG-ELISA and TLA-ELISA assays, sera from dogs naturally infected with Hepatozoon canis, Ehrlichia canis, Babesia vogeli canis, Anaplasma platys, Leishmania braziliensis and serum samples of dogs experimentally infected by cruzi were used in acute and chronic phases. The TLA-ELISA test, which had 98.8% specificity and 85% sensitivity, showed a cross reaction to Ehrlichia canis and Babesia vogeli canis, whereas in the LPG-ELISA test there was no cross-reaction in sera from dogs infected with none of the agents tested. Serum samples from nine dogs in 10 dogs without clinical signs, classified as stage I of CVL, were positive in the LPG-ELISA, whereas the TLA-ELISA did not show seroreactivity for any of these samples. LPG-ELISA also showed higher reactivity intensity in sera from dogs in stage II of LVC when compared to TLA-ELISA. In conclusion, the surface LPG of L. infantum was recognized by sera from infected dogs and demonstrated to be a tool with high detection power of dogs with no clinical signs. The results allow to recommend the application of the LPG-ELISA for the serological diagnosis of CVL. Keyword: dogs;immunodiagnosis visceral leishmaniasis;lipophosphoglycan