Obtenção, caracterização físico-química, imunológica e hipoalergização do alérgeno recombinante Blo t 2 visando o desenvolvimento de imunoterapia para alergia ao ácaro Blomia tropicalis

Abstract

Introdução: Nas últimas décadas a prevalência das doenças alérgicas tem aumentando notavelmente a nível mundial. Essas doenças são consideradas um problema de saúde pública devido a sua morbidade e altos custos para os cofres públicos. Blomia tropicalis é um ácaro da poeira causador de doenças alérgicas em regiões tropicais e subtropicais onde cerca de 55% a 93% dos pacientes alérgicos destas regiões estão sensibilizados contra o extrato total deste ácaro. Já foi evidenciado que alguns grupos de alérgenos apresentam importância clínica, contudo a relevância do grupo 2 dos alérgenos de B. tropicalis ainda está em debate. Até agora existem poucas informações sobre o Blo t 2 assim como sobre a sua reatividade cruzada com outros alérgenos de ácaros da poeira. Metodologia: As sequências recombinantes de duas isoformas de rBlo t 2 (rBlot 2.2 e 2.5) e de um mutante hipoalergênico derivado deste antígeno foram harmonizadas, transformadas e expressas na cepa de E. coli SHuffle® T7. As proteínas foram purificadas em condições não desnaturantes, através de cromatografia de troca iônica e exclusão por tamanho no caso do mutante. A caracterização físico-química foi realizada utilizando dicroísmo circular (CD) e espectroscopia de infravermelho com transformação de Fourier (FTIR), assim como espectrometria de massa (sigla em inglês: MS). A alergenicidade foi determinada por Immunoblot, ELISA e ensaio de liberação de mediadores inflamatórios usando basófilos humanizados de rato (huRBL). A reatividade cruzada com o homologo Der p 2 foi realizada utilizando ELISA de inibição Resultados: Os antígenos rBlot 2.2 e 2.5 e o mutante foram expressos como proteínas solúveis e purificadas sem uso de cauda de histidina. O espectro de CD de rBlo t 2.2 e 2.5 foram típicos para proteínas com um conteúdo misturado de folha e .hélices. A interpretação dos espectros FTIR revelou elementos de estrutura secundária, principalmente, na área correspondente as folhas . Quase 54% (24/44) dos soros dos pacientes alérgicos à B. tropicalis continham anticorpos IgE anti - rBlo t 2 nativo e nenhum reagiu com o mutante hipoalergênico; foi também observado que o alérgeno nativo teve a capacidade de induzir a liberação do mediador inflamatório -hexosaminidase, porém o mutante não demonstrou esta capacidade. Por outro lado, o rBlo t 2 mostrou baixa reatividade cruzada com Der p 2, determinado por ELISA de inibição. ix Conclusão: Foram expressas, purificadas e caracterizadas com sucesso duas isoformas do alérgeno de Blomia tropicalis rBlo t 2, e um mutante hipoalergênico derivado desta molécula denominado de rBlo t 2_8X. Além disso confirmamos que rBlo t 2 é um alérgeno importante, pois foi capaz de induzir sensibilização na população brasileira, podendo ser utilizado para diagnóstico e para o desenvolvimento de imunoterápicos.

Background: In recent decades, the prevalence of allergic diseases has remarkably increased worldwide. Asthma is one of the most important diseases and is considered as a public health problem. Blomia tropicalis is a common house dust mite that is associated with allergic symptoms in tropical and subtropical regions. Around 55% to 93% of the allergic patients of these regions are sensitized against the total extract of this mite. However, the clinical importance of group 2 allergens from this acarid is still under debate. Until now only scarse information of Blo t 2 is available and its cross-reactivity with others group 2 allergens from house dust mites is unknown. Methods: Two recombinants isoforms of Blo t 2 and a derivative mutant from it were codon-harmonized, transformed and expressed in the E. coli strain Shuffle T7. The proteins were purified under non-denaturing conditions via anion exchange chromatography and size-exclution chromatrography. Physico-chemical characterization was performed using circular dichroism (CD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) as well as mass spectrometry (MS). The allergenicity was determined by immunoblot, ELISA and mediator release assays using a humanized rat basophil leukemia (huRBL) cell line and cross-reactivity assay using inhibition ELISA. Results: Both, the rBlo t 2 wild type and the mutant were expressed as soluble proteins in E. coli. The CD spectrum of rBlo t 2 was typical for proteins with a mixed -fold with elevated sheet content. Interpretation of the FTIR spectra revealed secondary structure elements mainly in the area corresponding to -sheets. Almost 54 % (24/44) of Brazilian patients allergic to Blomia tropicalis reacted with rBlo t 2 and have the capacity to induce beta-hexosaminidase release in RBL cells. Furthermore, rBlo t 2 showed low cross-reactivity with rDer p 2 as determined by inhibition ELISA. Conclusion: We successfully expressed, purified and characterized two isoforms of the allergen of Blomia tropicalis rBlo t 2, and a hypoallergenic mutant derived from this molecule, the rBlo t 2.8. In addition, we confirmed that rBlo t 2 is an important allergen xi and induces sensitization in the Brazilian population, therefore it should be considered for the diagnosis and development of immunotherapy for B. tropicalis allergy.