Proteína híbrida hipoalergênica BTH2 e seu uso potencial no tratamento da alergia ao ácaro Blomia tropicalis

Abstract

Introdução: Blomia tropicalis é considerada a espécie de ácaro mais proeminente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Um aumento nas taxas de sensibilização a esse ácaro tem sido observado, principalmente com altos níveis de IgE contra dois alérgenos maiores: Blo t 5 e Blo t 21. Atualmente, os protocolos de imunoterapia com alérgenos (AIT) nessas regiões têm sido realizados usando extratos brutos, que apresentam desvantagens quando comparados com as novas abordagens: os derivados hipoalergênicos. Objetivo: Mapear o panorama tecnológico da produção de preparações alergênicas para AIT e definir qual a tecnologia mais vantajosa para desenvolver uma molécula híbrida hipoalergênica Blo t 5/Blo t 21, que possa potencialmente ser usada para combater reações alérgicas causadas por B. tropicalis. Métodos: Uma análise proteômica do extrato de B. tropicalis foi realizada para encontrar isoformas ou variantes do Blo t 5. Duas variantes denominadas rBlo t 5short e rBlo t 5long e uma versão curta de Blo t 21 foram expressas em suas formas recombinantes. O desenho in silico das proteínas híbridas de B. tropicalis foi realizado utilizando o software MAESTRO® e quatro proteínas híbridas foram escolhidas para expressão heteróloga. Todas as proteínas avaliadas neste trabalho foram purificadas por cromatografia de troca iônica e exclusão por tamanho, bem como caracterizadas através de múltiplos experimentos físico-químicos e imunológicos. Resultados: A análise proteômica revelou um padrão de degradação específico no motivo N-terminal de Blo t 5. A ausência deste motivo não influenciou o potencial alergênico da molécula, mas a variante curta apresentou mudanças na estabilidade de enovelamento e resistência a proteólise endolisossomal. Entre os híbridos hipoalergênicos, BTH2 apresentou a menor reatividade de IgE e capacidade de induzir degranulação de basófilos, bem como atenuou a inflamação das vias áreas em camundongos, sem a necessidade de mudanças drásticas nos parâmetros estruturais da molécula. Conclusões: Os tipos de tecnologia mais inovadoras para a produção de hipoalérgenos são as abordagens in silico. Blo t 5short é o melhor modelo para o desenho de um hipoalérgeno. BTH2 foi o candidato vacinal mais promissor e tem o potencial de ser usado para tratar pacientes co-sensibilizados com dois alérgenos maiores. No entanto, estudos futuros sobre sua imunogenicidade, usando células mononucleares do sangue periférico de pacientes atópicos e modelos in vivo de murinos, são necessários para considerar este alérgeno híbrido como um novo candidato vacinal em imunoterapia com alérgeno.

Introduction: Blomia tropicalis is considered the most prominent mite species in the tropical and subtropical regions of the world. An increase in sensitization rates to this mite has been reported, mainly with high IgE levels against the two major allergens: Blo t 5 and Blo t 21. Currently, allergen immunotherapy protocols in these regions have been performed using crude extracts, which have disadvantages when compared to the new approaches: the hypoallergenic derivatives. Aim: We aimed to map the technology landscape of the production of allergen preparations for AIT and determine the most advantageous technology for the development of a hypoallergenic Blo t 5/Blo t 21 hybrid molecule, that can potentially be used to tackle allergic reactions caused by B. tropicalis. Methods: A proteomic analysis of B. tropicalis extract was performed to find isoforms or variants of Blo t 5. Two variants termed rBlo t 5short and rBlo t 5long and a shortened version of Blo t 21 were expressed in their recombinant forms. In silico design of B. tropicalis hybrid proteins was performed using MAESTRO software and four hybrid proteins were chosen for heterologous expression. All proteins in this work were purified by ion exchange and size exclusion chromatography, as well as characterized through several physicochemical and immunological experiments. Results: MS-analysis revealed a specific degradation pattern at the N-terminal motif of Blo t 5. The absence of this motif did not influence its allergenic potential, but the shortened variant displayed changes in folding stability and endolysosomal proteolysis resistance. Among the hypoallergenic hybrids, BTH2 has shown the lowest IgE reactivity and ability to induce basophil degranulation, as well as it attenuated the induced airway inflammation in mice, without the need of drastic changes in structural parameters of the molecule. Conclusions: The most innovative types of technology for the production of hypoallergens are knowledge-based in silico approaches. Blo t 5short is the best template for the design of a hypoallergen. BTH2 was the most promisor vaccine candidate and has the potential to be used to treat patients co-sensitized with these major allergens. Nevertheless, future studies on BTH2 immunogenicity, using peripheral blood mononuclear cells of atopic patients and murine in vivo models evalutating T-cell priming, are required to consider this hybrid allergen as a novel allergen immunotherapy/vaccine candidate.