Detecção e caracterização molecular de Streptococcus pneumoniae diretamente de fluidos corpóreos

Abstract

Streptococcus pneumoniae é um dos principais agentes causadores de doenças invasivas graves como: pneumonia, meningite e septicemia. Estima-se o óbito em cerca de 2,0 milhões de crianças em países em desenvolvimento. O padrão ouro para diagnóstico é a cultura, mas a sua sensibilidade é baixa e por isso o aprimoramento no diagnóstico dos casos continua um desafio. O objetivo do presente estudo foi avaliar o uso de técnicas moleculares diretamente em líquor visando detectar e caracterizar genotipicamente Streptococcus pneumoniae em casos de meningite. Um estudo prospectivo de corte transversal foi realizado no Hospital Couto Maia, no período entre abril de 2006 a dezembro de 2010. As amostras de líquor foram selecionadas de acordo com critérios de inclusão como celularidade superior a 100 células/mm3 e/ou Glicorraquia inferior a 40 mg/dl e/ou Proteinorraquia superior a 65 mg/dl, e foram submetidas a análises de rotina do hospital, e posteriormente testadas por técnica de PCR em tempo real para detecção de S. pneumoniae, usando como alvo o gene lytA e a reação de PCR-Multiplex para a dedução do sorotipo capsular. A caracterização genotípica foi realizada através da técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). Foram analisadas 1141 amostras de líquor provenientes de pacientes com suspeita clínica de meningite bacteriana. Destas, 92 amostras foram positivas para S. pneumoniae por PCR em tempo real. Das quais, 68 amostras (73,9%) foram cultura positiva e 24 (26,1%) cultura negativa. Os sorotipos de 21 dos 24 casos cultura negativa foram deduzidos. Cerca de 46% dos sorotipos encontrados nos casos cultura negativa, foram não vacinais. Dentre os sorotipos vacinais mais frequentes estavam o 6A/B/C com 6 casos (25%), 14 com 3 casos (12,5%), 23F com 2 (8,3%), 18A/B/C com 1 caso (4,2%) e 4 com 1 caso (4,2%). Do total de 24 casos cultura negativa, três casos (12,5%) não apresentaram positividade para qualquer dos 40 sorotipos testados, embora tenham apresentado positividade para o gene cpsA, permanecendo então como não determinados. Seis amostras (25%) tiveram genótipo caracterizado por MLST, sendo definidos os STs 750, 6403 e 2814. Este estudo conclui que as técnicas moleculares de PCR em tempo real e Multiplex PCR podem ser bastante úteis quando aplicadas diretamente em espécimes clínicos, possibilitando uma melhor detecção e diagnóstico dos casos, mesmo quando todas as outras técnicas diagnósticas convencionais não são capazes de fazê-lo, além de proporcionar um ganho de informações epidemiológicas que não seriam possíveis de serem obtidos por métodos convencionais, devido à ausência de positividade das culturas bacteriológicas.

Streptococcus pneumoniae is a major cause of severe invasive diseases such as pneumonia, meningitis and bacteremia. It is estimated death in about 2.0 million children in developing countries. The gold standard for diagnosis of this agent is the culture, but its sensitivity is low and therefore the accurate diagnosis of cases of pneumococcal meningitis remains a challenge. The aim of this study was to evaluate the use of molecular techniques to detect directly in CSF samples, and genotype Streptococcus pneumoniae in meningitis cases. A prospective cross-sectional study was conducted at Hospital Couto Maia, in the period from April 2006 to December 2010. The CSF samples were selected according to inclusion criteria as cellularity above 100 cells/mm3 and / or CSF glucose less than 40 mg/dl and / or protein levels over than 65 mg / dl, and were submitted to routine hospital and subsequently tested by PCR in real time for the detection of S. pneumoniae, using targeting the lytA gene and PCR-Multiplex for the deduction of capsular serotype. The genotypic characterization was performed by Multilocus Sequence Typing technique (MLST). One amount of 1141 CSF samples were collected from patients with suspected bacterial meningitis and submitted for analysis. Of these, 92 samples were positive for S. pneumoniae by real-time PCR. Of which, 68 samples (73.9%) were culture positive and 24 (26.1%) culture negative. The serotypes of 21 of the 24 culture-negative cases were found. About 46% of the serotypes found in culture-negative cases were non vaccine types. Among the most common vaccine serotypes were the 6A/B/C with 6 cases (25%), 14 with 3 cases (12.5%), 23F with 2 (8.3%), 18A/B/C with one case (4.2%) and 4 with 1 case (4.2%). Of the total of 24 culture-negative cases, three cases (12.5%) showed positivity for any of the 40 serotypes tested, although they presented positive result for the gene CPSA amplification and remain as not determined. Six samples (25%) had the genotype characterized by MLST, the STs being set 750, 6403 and 2814. This study concludes that the molecular techniques of real-time PCR and multiplex PCR can be useful when applied directly on clinical specimens, enabling better detection and diagnosis of cases, even when all other conventional diagnostic techniques are not able to do it, and provide a gain of epidemiological information that would not be possible to obtain by conventional methods, due to the absence of positive bacterial cultures.