Resposta inflamatória em co - culturas de células glia/neurônio à Neospora caninum : possíveis papéis da indolamina 2,3 dioxigenase e ciclooxigenase

Abstract

O parasito Neospora caninum é um protozoário intracelular obrigatório que tem despertado especial interessse na Medicina Veterinária por causar desordens neuromuscular em cães e abortamentos em vacas gestantes. A resposta imune sistêmica contra o parasito é tipicamente do perfil Th1, com síntese de citocinas próinflamatórias, principalmente IFN, responsável pela redução da proliferação parasitária. Por outro lado, este perfil de resposta modifica-se durante o período gestacional, em que o balanço da resposta Th1 e Th2 aparentemente favorece a sobrevivência do concepto. Semelhante a isto, observa-se o mesmo padrão de resposta no sistema nervoso central (SNC), local de encistamento do parasito. Estudos anteriores apontaram que IDO (indolamina 2,3 dioxigenase) é modulada por IFN e que participa no controle da proliferação parasitária. Em estudos de neuroinflamação usando co-culturas de células gliais/neurônios infectadas por N. caninum, observou-se controle da proliferação parasitária por um mecanismo independente da enzima óxido nítrico sintase induzida por IFN. No interesse de esclarecer o mecanismo de controle parasitário neste modelo in vitro, a atividade da IDO e da ciclooxigenase 2 (COX-2) foram estudas. Co-culturas celulares glia/neurônios obtidas de ratos foram tratadas com o inibidor da IDO (1-metil triptofano/10-3M/mL) e com inibidores da COX-1 (indometacina10-6 M/mL) e da COX- 2 (nimesulida/10-6 M/mL) antes da infecção com taquizoítos de N.caninum (1:1 célula:parasito). Após 72 horas de infecção, as atividades enzimáticas foram avaliadas e seus fenótipos foram determinados usando anticorpos anti-βIII tubulin, OX-42 and GFAP para observar neurônios, microglia e astrócitos respectivamente. O perfil da resposta imunológica foi determinado por dosagem das citocinas IL-10, IFN e TNF pelo ensaio de ELISA. Notou-se duas vezes mais o aumento na atividade da enzima IDO em co-culuturas infectadas pela dosagem de cinurenina. Em culturas tratadas com o inibidor da IDO (1-MT) e infectadas com taquizoitos ocorreu aumento na proliferação parasitária de aproximadamente 40%, bem como aumento na atividade da IDO. Pertinente a atividade da COX-2, culturas infectadas produzem PGE2, enquanto tratamento com nimesulida permite o crescimento parasitário e induz perda de aproximadamente 30% e 50% de astrócitos e microglia respectivamente, no entanto os neurônios foram preservados. A infecção por taquizoítos promove síntese de IL-10 e TNF, ainda na presença do inibidor da IDO, mas não ocorre liberação de IFN. Estes dados indicam que neste modelo experimental a atividade da IDO é ativada por um mecanismo independente IFN e que o controle parasitário pode ser mediado pelo efeito sinérgico de PGE2 e TNF. Assim, a ativação da COX-2 parece ser um importante via de controle, ao passo que PGE2 associada a IL-10 podem modular a inflamação e permitem a continuidade do parasitismo.

Neospora caninum is an obligate intracellular protozoan that has been very studied by Veterinary Medicine because it causes neuromuscular disorders in dogs and abortion in cattle. The protective systemic immune response against this parasite is predominantly Th1 pattern, which there is proinflammatory cytokines production, mainly IFN, responsible for reduction of parasite burden. However, this response profile appears to be modified during pregnancy in chronically infected animals, in which a balance of production of Th1 and Th2 cytokines appears to favors fetal survival. The same was suggested occur in the central nervous system (CNS), local of parasite encystment. Previous data showed that IDO (indolamine 2,3 dioxygenase) is modulated by IFN in cell proliferation control. In studies of neuroinflammation using neuro-glia co-cultures infected by Neospora caninum, it was verified parasite control by a mechanism independent of type 2 nitric oxide synthetase (iNOS) induced by IFN. In order to clarify the mechanism of parasite control in this in vitro model, the activities of IDO and cyclooxygenase 2 (COX-2) were studied. Co-cultures of glia/neuron obtained from rat brains were treated with the inhibitor of IDO (1-methyl tryptohan/10-3M/mL) and with inhibitors of COX-1 (indomethacin/10-6 M/mL) and COX-2 (nimesulide/10-6 M/mL) before infection with tachyzoites of N.caninum (1:1 cell:cell). After 72 hours enzymes activities were evaluated and cell phenotypes determinate using βIII tubulin, OX-42 and GFAP to observe neurons, microglia and astrocytes respectively. Immunological profile of response was determinate by ELISA tests of IL-10, IFN and TNF. It was verified that parasite infection in co-cultures increased twice IDO activity measured by kinurenin releasing. In cultures treated with IDO inhibitor 1-MT and infected with tachyzoites it was verified about 40% of parasite proliferation and an increasing of enzyme activity. Concerning to COX-2 activity, infected cultures stimulated the release of PGE2, while nimesulide allowed the parasitic growth and a lost of 30 or 50% of astrocytes and microglia respectively, however was preserved neurons in cultures infected. Infection increases IL-10 and TNF even upon IDO inhibition but it does not release IFN. These data indicate that in this in vitro system IDO is activated by a mechanism independent of IFNy and parasite control could be mediated by synergistic effects of PGE2 and TNF. In fact, COX-2 activation seems to be an important via in parasite control and PGE2 associated to IL-10 besides to modulate the inflammation, allows continuity of parasitism.