Padronização do ensaio imunoenzimático (elisa) utilizando anti-igg de cão ou proteína a conjugados à peroxidase para o diagnóstico da leishmaniose visceral em canídeos silvestres

Abstract

No presente estudo, é descrita a padronização da técnica de imunoensaio enzimático (ELISA) para o sorodiagnóstico da infecção causada por Leishmania em canídeos silvestres brasileiros. Na América do Sul, a leishmaniose visceral (LV) é causada pela L. chagasi, sendo alguns canídeos considerados reservatórios naturais do parasito. A resposta imunológica à Leishmania é pouco estudada nos canídeos silvestres, que parecem apresentar resistência natural ao parasito. Foram estudadas amostras de soro/plasma obtidas de 12 canídeos cativos: sete lobos-guará (Chrysocyon brachyurus), três raposinhas (Lycalopex vetulus) e dois cachorros-do-mato (Cerdocyon thous). Dentre os canídeos estudados, um C. brachyurus e uma L. vetulus cativos em área endêmica para a LV, apresentavam em seu histórico clínico positividade na IFI e na técnica de PCR em aspirados de medula óssea para Leishmania sp. Foram então realizados diferentes ensaios imunoenzimáticos com o conjugado anti-IgG de cão e proteína A, que detectaram quatro (04/12) e três (03/12) C. brachyurus soropositivos para Leishmania sp. no ELISA com os respectivos conjugados. Os testes foram capazes de distinguir claramente as amostras positivas das negativas, uma vez que a média das densidades ópticas (DOs) das amostras negativas foram 4,8 vezes mais baixa do que a média das DOs dos positivos no ensaio com o conjugado anti-IgG de cão e 15,5 vezes nos testes com a proteína A. No Western Blot foi detectado um total de 22 bandas, com destaque para as de peso molecular 19, 22, 24, 45 e 66 kDa, presentes nas amostras de três C. brachyurus com soropositividade no ELISA indireto. Entretanto, as bandas 212, 32 e 23 kDa foram constatadas somente nos dois C. brachyurus com maiores valores de DOs. Os testes ELISA com a proteína A e o conjugado anti-IgG de cão apresentaram uma concordância excelente (Kappa = 1 p. 0,001) e moderada com o Western Blot respectivamente. O ensaio com a proteína A mostrou ser adequado a testes sorológicos de triagem, mas o ideal ainda seria o desenvolvimento de conjugados com anticorpos espécie-específico para padronização de ELISA indireto para as diferentes espécies silvestres.

In the present study, the standardization of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the serodiagnosis of infection by Leishmania in brazillian species of wild canids is described. In South America, visceral leishmaniosis (VL) is caused by L. chagasi, being some wild canids considered natural reservoirs of the parasite. The immunological response to Leishmania is not studied enough in the wild canids, which seem to show natural resistance to the parasite. Samples of serum/plasma from 12 captive wild canids were studied: seven maned wolves (Chrysocyon brachyurus), three hoary foxes (Lycalopex vetulus) and two crabeating foxes (Cerdocyon thous). Among the canines studied, a C. brachyurus and L. vetulus captives in an area endemic for VL, presented in their clinical history a positivity in Indirect Immunofluorescence Reaction, RIFI, and Polymerase Chain Reaction, PCR, in bone marrow aspirates for Leishmania sp. Were then performed with different immunoassays conjugated anti-dog IgG and protein A, which detected four (04/12) and three (03/12) C. brachyurus seropositive for Leishmania sp. by ELISA with their conjugates respectively. The tests were able to clearly distinguish the negative and positive samples, as the mean optical density (OD) of the negative samples was 4.8 times lower than those of the average of the positive in test with anti-IgG conjugate dogs and 15.5 times in the tests with protein A. Western blot was detected in a total of 22 bands, especially those of molecular weight 19, 22, 24, 45 and 66 kDa present in the samples of three C. brachyurus with seropositivity in ELISA. However, bands 212, 32 and 23 kDa were observed in only two C. brachyurus with higher values of OD.. The ELISA with protein A and conjugated anti-dog IgG showed excellent agreement (Kappa = 1 p. 0.001) and moderate (Kappa = 0,8 p. 0,0015) with the Western Blot respectively.. Even though the test with protein A has shown adequate to screening tests, the ideal would be the development of conjugates with species-specific antibodies for the standardization of indirect ELISA for different wild species.