Aplicação do planejamento Box-Behnken na otimização de método de extração de flavonoides usando extração acelerada com solventes (ASE) e quantificação de marcadores químicos por CLAE-DAD-UV em espécies do gênero Passiflora

Abstract

O presente trabalho descreve a aplicação de planejamento Box-Behnken para otimização de método de extração de flavonoides, usando extração acelerada com solventes (ASE), e o desenvolvimento e validação de um método analítico por CLAE com detecção por arranjo de diodos (DAD), para a quantificação dos principais marcadores químicos nas folhas de Passiflora alata, P. capsularis, P. cincinnata, P. edulis f. flavicarpa, P. edulis f. edulis, P. galbana, P. gibertii, P. maliformis, P. malacophylla, P. morifolia, P. mucronata, P. quadrangularis, P. racemosa, P. setacea, P. suberosa, P. tenuifila e P. vitifolia, cultivadas na Embrapa Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas-BA. A otimização do método de extração no extrator acelerado com solventes (ASE) foi realizada através de um planejamento Box- Behnken de três fatores, proporção da solução hidroetanólica (%), temperatura e nº de ciclos e três níveis experimentais (+1, 0, -1), com o objetivo de se obter as melhores condições para a determinação do teor de fenólicos totais, flavonoides totais e rendimento (%), avaliando simultaneamente as respostas processadas. As condições otimizadas foram a proporção hidroetanólica 64% (v/v), 80 ºC e 5 ciclos de extração. Um método analítico de perfil cromatográfico foi desenvolvido e validado, utilizando CLAE-DAD, para a análise dos extratos hidroetanólico 64% (v/v) das folhas de espécies de Passiflora estudadas. Os perfis cromatográficos das espécies de Passiflora demonstraram ser bastante diferentes entre si, o que possibilitará a sua aplicação no controle de qualidade químico, na identificação e determinação da autenticidade de fitoterápicos produzidos a partir de diferentes espécies de Passiflora de nossa flora. O método cromatográfico validado foi aplicado na quantificação dos flavonoides C-glicosilados, orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina e rutina nas diferentes espécies de Passiflora. O teste de atividade antioxidante utilizando a metodologia do radical estável DPPH demonstrou que os extratos de P. capsularis, P. cincinnata, P. edulis f. flavicarpa, P. edulis f. edulis, P. galbana, P. gibertii, P. malacophylla, P. suberosa, P. tenuifila e P. vitifolia possui atividade antioxidante quando comparado ao padrão ácido gálico. No teste de atividade anticolinesterásica, as espécies de Passiflora não apresentaram atividade inibitória da enzima acetilcolinesterase. A atividade citotóxica in vitro utilizando o método de MTT demonstrou que, dos extratos de Passiflora analisados, somente o extrato de P. alata apresentou potencial citotóxico relevante, com percentual de inibição do crescimento tumoral maior que 90%, frente as linhagens de células do ovário – humano, carcinoma do cólon e glioblastoma.

This work describes an application of Box- Behnken experimental planning for the optimization of a method for flavonoid extraction employing accelerated solvent extraction (ASE), and development and validation of an analytical method by HPLC with diode array detection (DAD) for quantification of the major chemical markers in the leaves of Passiflora alata, P. capsularis, P. cincinnata, P. edulis f . flavicarpa, P. edulis f. edulis, P. galbana, P. gibertii, P. maliformis, P. malacophylla, P. morifolia, P. mucronata, P. quadrangularis, P. racemosa, P. setacea, P. suberosa, P. tenuifila and P. vitifolia grown at Embrapa Mandioca e Fruticultura, Cruz das Almas-BA. The optimization of the extraction method on accelerated solvent extractor (ASE) was performed by using a Box- Behnken application of three factors, hydroethanol solution proportion (%), temperature and number of ASE cycles and three experimental levels (+1, 0, - 1), with the purpose to obtain the best conditions for the determination of extract yield (%), total phenolic contentand total flavonoid, while assessing the responses processed. The observed optimized conditions were: proportion hydroethanol 64% (w/w), 80 °C and 5 cycles of extraction. An analytical profile chromatographic method was developed and validated using HPLC-DAD for the analysis of hydroethanolic extract 64% (w/w) of the Passiflora leaves species studied. The chromatographic profiles of the Passiflora species proved to be quite different, which enables its application in the chemical quality control, identification and determination of the authenticity of herbal medicines produced from different Passiflora species from brazilian flora. The validated chromatographic method was applied in the quantification of flavonoid C- glycosides, orientin, isoorientina , vitexin, isovitexin and rutin in different species of Passiflora. The test of antioxidant activity using the methodology of the stable radical DPPH showed that extracts of P. capsularis, P. cincinnata, P. edulis f. flavicarpa, P. edulis f. edulis, P. galbana, P. gibertii, P. malacophylla, P. suberosa, P. tenuifila and P. vitifolia has antioxidant activity when compared to standard gallic acid. In the test of anticholinesterase activity, the Passiflora species showed no inhibitory activity of the enzyme acetylcholinesterase. The in vitro cytotoxic activity using the MTT method showed that extracts of Passiflora analyzed, only the extract from P. alata showed cytotoxic relevant to the percentage of tumor growth inhibition higher than 90% against the ovarian cell line - human colon carcinoma and glioblastoma.