Efeitos de flavonoides sobre a ativação microglial e viabilidade de células de glioblastoma

Abstract

A capacidade reduzida da resposta imunológica no microambiente do glioblastoma é principalmente devido à interação microglia/glioma e está relacionada à sua agressividade. Nossos estudos anteriores demonstraram que os flavonoides derivados de plantas podem atuar como inibidores de crescimento de linhagens celulares humanas de glioblastoma, em especial o flavonoide rutina inibe o crescimento e apresenta capacidade morfogênica, ainda estimula a libertação de agentes imunomoduladores como TNF e NO por astrócitos e microglia em culturas primárias de ratos. O objetivo desse estudo foi verificar a viabilidade de linhagens celulares de glioblastoma humano tratadas com flavonoides, bem como caracterizar essas células quanto à expressão de proteínas do citoesqueleto e morfologia, ainda, investigar se os flavonoides rutina e quercetina, nas concentrações de 50μM e 100μM, podem modular a resposta imunológica em co-cultura microglia/glioma. Como demonstrado através do teste MTT, após 72h de exposição com os flavonoides, ocorreu inibição dose-dependente da viabilidade das células TG1, U251 e GL15. A caracterização dessas linhagens revelou marcação conjunta de GFAP, beta III tubulina e Nestina em diferentes intensidades e localização. Além disso, verificamos diminuição da capacidade de formação de esferóides em culturas de células TG1 tratadas com rutina. Em culturas de célula C6 a viabilidade não foi afetada após a exposição direta aos flavonoides rutina e quercetina nas concentrações de 50 - 100μM por 48h. O teste azul de tripan revelou uma redução dessa viabilidade em ambos os flavonoides testados diretamente. Já durante exposição indireta de meios provenientes de culturas de microglia tratadas com rutina, observamos redução na viabilidade em C6. Além disso, observamos um aumento na expressão de OX-42 em culturas de microglia após a exposição com flavonoides rutina e quercetina, indicando sua ativação. Foi realizado em co-culturas microglia/glioma a marcação para isolectina B4, verificamos que o flavonoide rutina induziu aumento na proliferação de microglia após contagem das células isolectina positivas. Ainda, o teste ELISA realizada em culturas microgliais mostrou que os níveis de TNF foram aumentados em culturas tratadas com rutina 100μM ou quercetina 50- 100μM. A dosagem de nitrido mostrou aumento significativo somente após tratamento com quercetina 100μM. Através da citometria verificamos redução de pSTAT3 e NFkB em culturas de C6 e a análise ultraestrutural revelou figura de mielina, vacúolo fagocítico durante interação microglia/glioma. Verificamos ainda que houve aumento na intensidade da marcação de células apoptóticas quando tratadas com quercetina 100μM em gliomas, já com rutina ocorreu sutil marcação de anexina também em gliomas. Para quantificação dos vacúolos autofágicos em gliomas, utilizamos o corante fluorescente laranja de acridina. Em rutina 100 μM observamos aumento na intensidade de fluorescência, já o tratamento com quercetina verificamos aumento discreto na formação dos vacúolos autofágicos. Diversos estudos demonstram que o perfil de resposta Th1 está associado com um melhor prognóstico em pacientes com câncer. Esses achados sugerem que quercetina e rutina podem induzir mudanças no perfil regulatório da resposta microglial durante a interação com glioma, no entanto o flavonoide rutina mostrou um potencial melhor como imunomodulador. O entendimento da interação microglia/glioma será útil na elaboração de novas terapias baseadas na resposta imune contra o glioblastoma.