Análise metabolômica do plasma de indivíduos com osteonecrose secundária à doença falciforme

Abstract

A doença falciforme é a hemoglobinopatia mais frequente no Brasil e constitui problema de saúde pública mundial, com grande impacto na morbimortalidade da população acometida. Em portadores desta patologia a manifestação clínica articular predominante é a osteonecrose, que comumente evolui para doença terminal. Análises relacionadas a metabólitos e vias metabólicas desreguladas, em sistemas complexos, tornou-se uma ferramenta poderosa para investigar processos metabólicos, identificar potenciais biomarcadores e desvendar a reprogramação metabólica em várias doenças. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo principal utilizar uma abordagem metabolômica por ressonância magnética nuclear para identificar biomarcadores relacionadas à doença falciforme, bem como, à osteonecrose secundária a doença falciforme. Foi utilizado o plasma sanguíneo de indivíduos controle e de portadores de doença falciforme sem e com osteonecrose. Baseado no estágio clínico da osteonecrose, graduado com o método modificado de Ficat e Arlet, as amostras foram classificadas como estágio inicial, intermediário e avançado de osteonecrose. Para a obtenção dos espectros uni e bidimensionais foi utilizado um equipamento de ressonância magnética nuclear - Bruker Avance III de 14,1 Tesla - (600 MHz). A otimização do protocolo de preparo de amostras e aquisição dos espectros envolveu a utilização de diferentes sequências de pulso; Zg, Zgpr, Lcipnf2, Noesypr 1D bem como alguns protocolos de precipitação de proteínas com metanol. A identificação dos metabólitos foi realizada com o auxílio do software Chenomx NMR Suite 8.4. O processamento e a quantificação foram realizados no software NMRProcflow. As análises estatísticas foram realizadas no software MetaboAnalyst 3.0. Vinte e nove metabólitos foram identificados por RMN de 1H, incluindo 12 aminoácidos, 9 ácidos orgânicos, 4 lipídios, 3 compostos orgânicos, 1 carboidrato. O perfil metabólico do plasma sanguíneo do grupo controle foi significativamente distinto dos grupos de portadores de doença falciforme sem osteonecrose e com osteonecrose. Dezoito metabólitos com VIP score > 0,5 foram responsáveis pelas diferenças entre as amostras destes grupos. O Sn-glicerol-3-fosfocolina e a fenilalanina foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de doença falciforme. O 3-hidroxibutirato foi o metabólito com resultado mais promissor para estudos futuros de biomarcador de osteonecrose secundária à DF. A análise topológica de vias metabólicas revelou potencial relação entre doença falciforme e osteonecrose secundária à DF e algumas vias metabólicas, nomeadamente; metabolismo do nitrogênio, do piruvato, da tiamina, da arginina e prolina, da fenilalanina; biossíntese de aminoacil t-RNA, da fenilalanina, da tirosina e triptofano, da valina, leucina e isoleucina; glicólise ou gliconeogênese; degradação de valina, leucina e isoleucina; síntese e degradação de corpos cetônicos. As vias metabólicas que apresentaram maior impacto foram respectivamente; metabolismo do piruvato, metabolismo da arginina e prolina e metabolismo da fenilalanina. A análise de discriminante também revelou que o plasma dos portadores de osteonecrose secundária à DF em diferentes estágios de osteonecrose apresentavam perfil metabólico distinto. No plasma de sangue periférico quatorze metabólitos com VIP score > 0,5 foram responsáveis por esta diferença. A histidina e lactato foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de estadiamento de osteonecrose secundária à doença falciforme, sobretudo para o diagnóstico precoce desta patologia. A histidina, o VLDL + HDL e o citrato foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de estágios avançados de osteonecrose secundária à doença falciforme. A análise topológica de vias metabólicas revelou potencial relação entre os diferentes estágios de osteonecrose secundária à DF e algumas vias metabólicas, nomeadamente; biossíntese de aminoacil t-RNA, biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano, biossíntese de valina, leucina e isoleucina, metabolismo de glioxilato e dicarboxilato, metabolismo da fenilalanina, metabolismo do piruvato, degradação de valina, leucina e isoleucina e síntese e degradação de corpos cetônicos. As vias metabólicas que apresentaram maior impacto foram respectivamente; biossíntese de fenilalanina, tirosina e triptofano e metabolismo da fenilalanina. Estes resultados fornecem um forte evidência de uma assinatura metabólica para os indivíduos com doença falciforme e com osteonecrose secundária à DF, definida principalmente por um conjunto de vinte metabólitos com níveis alterados no plasma sanguíneo incluindo, citrato, 2-hidroxi-3-metilbutírico, tirosina, glicose, histidina, formato, glicina, acetona, prolina, sn-glicerol-3-fosfocolina, fenilalanina, 3-hidroxibutirato, lactato, creatina + creatinina, acetato, leucina + isoleucina e VLDL + HDL. Espera-se, que estes achados, ajudem a nortear futuras pesquisas na área e possa elucidar, ainda mais, as alterações bioquímicas na doença falciforme e na osteonecrose secundária a DF.

Sickle cell disease is the most common hemoglobinopathy in Brazil and constitutes a worldwide public health problem, with a great impact on the morbidity and mortality of the affected population. In patients with this pathology, the predominant joint clinical manifestation is osteonecrosis, which commonly progresses to terminal disease. Analyzes related to metabolites and unregulated metabolic pathways in complex systems have become a powerful tool for investigating metabolic processes, identifying potential biomarkers and unraveling metabolic reprogramming in various diseases. In this context, this work had as main objective to use a metabolic approach by nuclear magnetic resonance to identify biomarkers related to sickle cell disease, as well as to osteonecrosis secondary to sickle cell disease. Blood plasma was used from control subjects, patients with sickle cell disease and individuals with osteonecrosis secondary to sickle cell disease. Based on the clinical stage of osteonecrosis, graduated using the modified Ficat and Arlet method, the samples were classified as early, intermediate and advanced stages of osteonecrosis. To obtain the uni and bidimensional spectra, a nuclear magnetic resonance equipment - Bruker Avance III of 14.1 Tesla - (600 MHz) was used. The optimization of the sample preparation and spectrum acquisition protocol involved the use of different pulse sequences; Zg, Zgpr, Lcipnf2, Noesypr 1D as well as some protocols for protein precipitation with methanol. The identification of the metabolites was performed with the aid of the Chenomx NMR Suite 8.4 software. Processing and quantification were performed using the NMRProcflow software. Statistical analyzes were performed using MetaboAnalyst 3.0 software. Twenty-nine metabolites were identified by 1H NMR, including 12 amino acids, 9 organic acids, 4 lipids, 3 organic compounds, 1 carbohydrate. The metabolic profile of the blood plasma of the control group was significantly different from the groups of sickle cell without osteonecrosis and sickle cell with osteonecrosis. Eighteen metabolites with VIP score> 0.5 were responsible for the differences between the samples of these groups. Sn-glycerol-3- phosphocholine and phenylalanine were the metabolites with the most promising results for future investigations of the sickle cell disease marker. 3-hydroxybutyrate was the metabolite with the most promising result for future studies of osteonecrosis biomarker secondary to DF. The topological analysis of metabolic pathways revealed a potential relationship between sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF and some metabolic pathways, namely; metabolism of nitrogen, pyruvate, thiamine, arginine and proline, phenylalanine; biosynthesis of aminoacyl t-RNA, phenylalanine, tyrosine and tryptophan, valine, leucine and isoleucine; glycolysis or gluconeogenesis; degradation of valine, leucine and isoleucine; synthesis and degradation of ketone bodies. Among these metabolic pathways, the ones with the greatest impact were respectively; metabolism of pyruvate, metabolism of arginine and proline and metabolism of phenylalanine. The discriminant analysis also revealed that the plasma of patients with osteonecrosis secondary to DF in different stages of osteonecrosis have different metabolic profiles. In the peripheral blood plasma, fourteen metabolites with VIP score> 0.5 were responsible for this difference. Histidine and lactate were the metabolites with the most promising results for future investigations of osteonecrosis staging biomarkers secondary to sickle cell disease, especially for the early diagnosis of this pathology in peripheral blood plasma. Histidine, VLDL + HDL and citrate were the metabolites with the most promising results for future investigations of biomarker of advanced stages of osteonecrosis secondary to sickle cell disease in peripheral blood plasma. The topological analysis of metabolic pathways revealed a potential relationship between the different stages of osteonecrosis secondary to DF and some metabolic pathways, namely; aminoacyl biosynthesis t-RNA, phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis, valine, leucine and isoleucine biosynthesis, glyoxylate and dicarboxylate metabolism, phenylalanine metabolism, pyruvate metabolism, valine degradation, leucine and isoleucine degradation and body degradation and synthesis ketones. The metabolic pathways that had the greatest impact were respectively; biosynthesis of phenylalanine, tyrosine and tryptophan and metabolism of phenylalanine. These results provide strong evidence of a metabolic signature for individuals with sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF, defined mainly by a set of twenty metabolites with altered blood plasma levels including, citrate, 2-hydroxy-3-methylbutyric, tyrosine, glucose, histidine, format, glycine, acetone, proline, sn-glycerol-3-phosphocholine, phenylalanine, 3- hydroxybutyrate, lactate, creatine + creatinine, acetate, leucine + isoleucine and VLDL + HDL. It is hoped that these findings will help to guide future research in the area and may further elucidate the biochemical changes in sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF.