Avaliação metabolômica do plasma de crianças e adolescentes com anemia falciforme

Abstract

A anemia falciforme constitui um tipo de anemia em que a hemácia adquire a forma de foice, levando a vaso-oclusão, isquemia e inflamação; equivale a uma anemia hemolítica. Atinge uma parcela significativa da população brasileira, sendo necessária uma maior atenção para esta doença no ramo da pesquisa. A hidroxiureia é um medicamento eficaz no tratamento da anemia falciforme e melhora a qualidade de vida dos pacientes. Torna-se relevante a análise metabolômica voltada para esta doença, incluindo o estudo do metabolôma dos pacientes que utilizam este medicamento, já que o estudo das alterações do conjunto de metabólitos do plasma sanguíneo pode contribuir para o diagnóstico da doença e desenvolvimento terapêutico. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi realizar a análise metabolômica do plasma de crianças e adolescentes divididos em três grupos: pacientes com anemia falciforme que não utilizam a hidroxiureia (SCD); pacientes com anemia falciforme que utilizam a hidroxiureia (SCD_HDU); e indivíduos que não possuem anemia falciforme (controle). O sangue foi coletado das referidas crianças e adolescentes na faixa etária de 6 a 18 anos, e as amostras de plasma sanguíneo foram liofilizadas e submetidas a precipitação de proteínas e subsequente análise por Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN de 1H). Antes desta análise realizou-se a otimização de protocolo da aquisição de espectros, sendo selecionada a sequência de pulso Noesypr 1d, dentre as demais. Os espectros foram processados em diversas plataformas on-line de análises metabolômicas visando a identificação e a quantificação de metabólitos, bem como a realização das análises estatísticas multivariadas. Para tanto, utilizou-se o programa Chenomx suíte 8.4, e antes da quantificação foi feito o alinhamento de picos, ambos realizados no programa NMRProcFlow. As análises estatísticas multivariadas foram realizadas no programa MetaboAnalyst 2,0 e incluiram PLS-DA, validação cruzada, VIP scores e mapa de calor. Vinte e quatro metabólitos foram identificados, incluindo dez ácidos orgânicos, oito aminoácidos, além de outros compostos orgânicos. Através das análises estatísticas multivariadas foi possível comparar o conjunto de metabólitos dos grupos de participantes. A análise de PLS-DA revelou dissimilaridades no perfil metabólico do grupo controle e os grupos SCA e SCA_HDU. A análise dos três grupos resultou em oito metabólitos com VIP scores maiores ou iguais a 1, dentre os quais a leucina/isoleucina, prolina, ácidos graxos, creatina/creatinina, histidina, ácido 3-hidroxibutírico, glicerol e acetona. De acordo com o mapa de calor, a leucina/isoleucina, prolina, ácidos graxos, creatina/creatinina e glicerol possuem maiores concentrações no grupo SCD_HDU, e a histidina, ácido 3-hidroxibutírico e acetona possuem maiores concentrações no grupo controle. Este trabalho mostra a utilidade da análise metabolômica para a detecção de biomarcadores da anemia falciforme. Podem ser encontrados metabólitos com suas respectivas quantidades comparativas entre os grupos, característicos da anemia falciforme, bem como observadas as alterações do conjunto de metabólitos dos participantes, devido o uso da hidroxiureia. Os resultados descritos neste trabalho podem contribuir no diagnóstico e desenvolvimento terapêutico da doença, servindo como base para futuras investigações que envolvem o tema desta pesquisa.

Sickle cell anemia is a type of anemia in which the red blood cells take on a sickle shape, leading to vaso-occlusion, ischemia and inflammation. It affects a significant portion of the Brazilian population, which required greater attention for research purposes. Hydroxyurea is a drug that has effectively been used in the treatment of sickle cell anemia, improving the quality of life of patients. Metabolomics analysis focused on this disease is relevant, including the study of the metabolome of patients who use this drug, since the study of alterations in the set of blood plasma metabolites can contribute to the diagnosis of the disease and therapeutic development. In this context, the aim of this study is to carry out a metabolomics analysis of the plasma of children and adolescents divided into three groups: patients with sickle cell anemia who do not use hydroxyurea (SCD); patients with sickle cell anemia who use hydroxyurea (SCD_HDU); and individuals who do not have sickle cell anemia (control). Blood was collected from children and adolescents aged 6 to 18 years, and blood plasma samples were lyophilized and subjected to protein precipitation and subsequent analysis by Nuclear Magnetic Resonance of Hydrogen (1H NMR). Before this analysis, the optimization of the spectra acquisition protocol was performed, with the Noesypr 1d pulse sequence being selected. The spectra were processed in several online metabolomics analysis platforms aiming at the identification and quantification of metabolites, as well as the performance of multivariate statistical analyses. For this purpose, the Chenomx suite 8.4 program was used, and before the quantification, the peak alignment was performed, both performed in the NMRProcFlow program. Multivariate statistical analyzes were performed using the MetaboAnalyst 2.0 program and included PLS-DA, cross validation, VIP scores and heat map. Twenty-four metabolites were identified, including ten organic acids, eight amino acids, and other organic compounds. Through multivariate statistical analysis it was possible to compare the set of metabolites of the groups of participants. The PLS-DA analysis revealed dissimilarities in the metabolic profile of the control group and the SCA and SCA_HDU groups. The analysis of the three groups resulted in eight metabolites with VIP scores greater than or equal to 1, including leucine/isoleucine, proline, fatty acids, creatine/creatinine, histidine, 3-hydroxybutyric acid, glycerol and acetone. According to the heat map, leucine/isoleucine, proline, fatty acids, creatine/creatinine and glycerol have higher concentrations in the SCD_HDU group, and histidine, 3-hydroxybutyric acid and acetone have higher concentrations in the control group. This work shows the usefulness of metabolomic analysis for the detection of sickle cell anemia biomarkers. Metabolites can be found with their respective comparative amounts between the groups, characteristic of sickle cell anemia, as well as changes in the group of metabolites of the participants, due to the use of hydroxyurea, can be observed. The results described in this work can contribute to the diagnosis and therapeutic development of the disease, serving as a basis for future investigations involving the subject of this research.