Automatização de um bioensaio para a determinação de colesterol total

Abstract

No âmbito dessa dissertação desenvolveu-se um sistema de análise por injeção sequencial (SIA) com a utilização do módulo Lab-on-Valve (LOV) com potencialidades para ser usada na determinação do colesterol total em amostras de soro sanguíneo humano. Nesse trabalho optou-se pelo método enzimático, colorimétrico, em que o uso de solventes orgânicos está excluído. A determinação baseou-se na utilização de enzimas, extraídas de microrganismos, capazes de agir sobre os analitos de forma seletiva. Em presença da enzima colesterol esterase, o ester é convertido em colesterol que na presença da enzima colesterol oxidase (CO) dá origem a colestenona e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio formado, por ação catalítica da enzima peroxidase (POD) e com o reagente cromogênico constituído pela mistura de fenol e 4-aminoantipirina, dá origem a quinoneimina que apresenta máximo de absorção em 500 nm. A otimização do sistema foi feita levando em consideração a concentração e o volume das enzimas colesterol esterase, colesterol oxidase e a peroxidase, o volume do reagente cromogênico, bem como a concentração dos reagentes que o compõe, o tempo de reação, a ordem de aspiração e a temperatura do banho. As condições otimizadas para o método proposto são: 10 μL de amostra, 20 μL de reagente cromogênico, 10 μL de enzima colesterol esterase 10 U mL-1, 10 μL da enzima colesterol oxidase 4 U mL-1 e tempo de 6 minutos. A curva analítica de calibração apresentou uma faixa linear de trabalho de 6 - 40 mg dL-1 de acetato de colesterol com R2 = 0,998, e limites de detecção e quantificação de 2,3 mg dL-1 e 5,9 mg dL-1, respectivamente. A metodologia desenvolvida demonstrou ser robusta, de baixo custo, considerando os baixos volumes de reagentes e menor geração de resíduos e exibiu bons valores de repetibilidade (RSD < 4%) e de reprodutibilidade (RSD < 2%) em todos os ensaios realizados. A análise de amostras de referência de soro sanguíneo humano resultou em erros que não ultrapassaram a faixa de 5% quando foram comparadas ao valor de concentração teórico.

In this dissertation a sequential injection analysis system (SIS) was developed with the use of the Lab-on-Valve (LOV) module with potentialities to be used in the determination of total cholesterol in human serum samples. In this work we opted for the enzymatic method, colorimetric, in which the use of organic solvents is excluded. The determination was based on the use of enzymes, extracted from microorganisms, capable of acting on the analytes selectively. In the presence of the enzyme cholesterol esterase, the ester is converted to cholesterol which in the presence of the enzyme cholesterol oxidase (CO) gives rise to cholestenone and hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide formed by the catalytic action of the peroxidase enzyme (POD) and the chromogenic reagent consisting of the mixture of phenol and 4-aminoantipyrine gives quinoneimine, which exhibits maximum absorption at 500 nm. The optimization of the system was done taking into account the concentration and volume of the enzymes cholesterol esterase, cholesterol oxidase and peroxidase, the volume of the chromogenic reagent, as well as the concentration of the reagents that compose it, the reaction time, the order of aspiration and the bath temperature. The optimized conditions for the proposed method are: 10 μL of sample, 20 μL of chromogenic reagent, 10 μL of 10 U mL-1 cholesterol esterase enzyme, 10 μL of the enzyme cholesterol oxidase 4 U mL-1 and time of 6 minutes. The analytical calibration curve presented a linear working range of 6-40 mg dL-1 cholesterol acetate with R2 = 0.998, and limits of detection and quantification of 2.3 mg dL-1 and 5.9 mg dL-1 , respectively. The developed methodology proved to be robust, low cost, considering the low reagent volumes and lower generation of residues and showed good repeatability (RSD <4%) and reproducibility (RSD <2%) values ​​in all tests. Analysis of human blood serum reference samples resulted in errors that did not exceed the 5% range when compared to the theoretical concentration value.