O vírus linfotrópico de células T humana do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus humano
sexualmente transmissível, cujas principais manifestações clínicas são a Mielopatia
Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) e a
Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATLL). A HAM/TSP é uma manifestação
inflamatória do sistema nervoso central que pode resultar na perda parcial dos
movimentos dos membros inferiores. Embora muitos aspectos dos eventos que levam
ao desenvolvimento de doença não estejam esclarecidos, a resposta imune do
hospedeiro, principalmente a resposta celular desencadeada por células T CD8+
específicas, é reconhecida como um evento crucial. O objetivo desse trabalho é
investigar marcadores moleculares no vírus e no hospedeiro que possam estar
relacionaodos à manifestação de doença, principalmente a HAM/TSP. No Capítulo I,
foi realizada a busca por marcadores virais, no que diz respeito à apresentação
diferencial de epítopos, para os diferentes perfis clínicos. Para tanto, fizemos um
levantamento (Genbank) de 46 genomas completos do HTLV-1, e separamos as
regiões codificantes das proteínas Tax, HBZ, p12, gp21 e gp46. Tais regiões gênicas
foram avaliadas quanto a presença de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e em
seguida traduzidas para proteína. As variações moleculares foram representadas em
sequências de AA que foram submetidas ao IEDB (Immune Epitope Database a
Analysis Resource) para predição de epítopos lineares ligantes de moléculas de HLAI. Foi possível identificar 7 “alelos protéicos” para a proteína gp21, 23 para gp46, 20
para HBZ, 13 para a proteína Tax, e 15 para a proteína p12, todos distruídos entre
indivíduos ASS, fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Esporádico) e ATLL. Na predição,
foram identificados mais de 15.741 epítopos para p12, menor quantidade de epítopos
preditos e mais de 50.000 para Tax, com a maior quantidade de epítopos preditos. A
proteína p12 teve a maior proporção de epítopos específicos, também seguida pela
proteína Tax. A proteína HBZ teve os menores percentuais em todas as faixas de
especificidade. Os resultados encontrados para as proteínas estruturais gp46 e gp21
foram semelhantes. Não houve nenhuma especificidade/exclusividade dos alelos de
HLA entre as proteínas, “alelos protéicos” e/ou perfis clínicos do hospedeiro. Cada
proteína apresentou um alelo de HLA como sendo o mais frequente entre os “alelos
protéicos”, não havendo similaridade nessa ocorrência. E por fim, o alelo de HLA*A
32:01 foi citado entre os mais frequentes em todas as proteínas, e as proteínas gp21
e HBZ apresentaram perfis semelhantes no que se refere à ocorrência dos alelos de
HLA mais frequentes. O perfil clínico HAM/TSP foi o que apresentou o maior número
de variações moleculares entre as proteínas estudadas: foram 42 “alelos protéicos”
contra 19 de indivíduos com ATLL e 16 de indivíduos ASS (Não HAM/TSP). Os
achados de afinidade revelaram que dos 9 epítopos que apresentaram diferenças na
afinidade às moléculas de HLA, 6 deles estavam associados a indivíduos ATLL, 4 a
indivíduos sHAM/TSP e 2 a indivíduos ASS. Concluimos não haver um perfil de
apresentação de epítopos que esteja associado ao status clínico do hospedeiro, uma
vez que houve grande semelhança quanto aos alelos de HLA e quanto à posição dos
epítopos apresentados entre os “alelos protéicos”. No entanto, identificamos variações
moleculares importantes na predição dos epítopos especialmente nos genomas de
indivíduos com ATLL e HAM/TSP. No Capítulo II, buscamos por marcadores no
hospedeiro, em um grupo de indivíduos (HAM/TSP e assintomáticos) (N=44)
infectados. Para tanto, realizamos a determinação do Exoma através da Plataforma
Illumina e utilizando um chip para 551.004 SNPs. A taxa total de genotipagem das
amostras foi de 0,997001, com perda de 35.163 SNPs (~6%), identificadas 515.841
variantes. A determinação ancestral revelou uma proporcionalidade de contribuição
genética mais marcante para a origem africana na população estudada. Observamos
predominância de mulheres no grupo caso, como já foi documentado na literatura. A
média de idade dos indivíduos infectados foi de 59 anos (27-89 anos), sendo que a
carga proviral média destes é de 55.253,41/106 células. Dentre os SNPs identificados,
quatro deles se destacaram quanto às frequências alélicas nos grupos caso e
controle, e são eles: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C e rs376863_A. Após
análise de regressão multivariada, ajustada para ancestralidade, apenas os SNPs
“rs1265564” (p=7,2*10-4
) e “rs376863” (p=1,25*10-3
) se apresentam associados ao
desfecho. O SNP rs1265564, foi identificado no gene que codifica para a proteína
CUX-2 que está associada ao reparo de DNA oxidado por ação das espécies reativas
do oxigênio produzidas nos neurônios. Os quatro SNPs iniciais mostram estar em
desequilíbrio de ligação com outros SNPs, porém nenhum deles dos já descritos na
literatura e citados neste trabalho. Sugerimos uma busca minuciosa dos SNPs
indicados neste trabalho, bem como a associação de marcadores moleculares do
hospedeiro com marcadores virais, como forma de entender o processo de infecção
e manifestação de doença como resultado de uma integração complexa e bem
sucedida.
Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a sexually transmitted human
retrovirus. Its main clinical manifestations are HTLV-Associated Myelopathy/Tropical
Spastic Paraparesis (HAM/TSP) and T-Cell Leukemia / Lymphoma of the Adult (ATLL).
HAM/TSP is an inflammatory disorder of the central nervous system that can result in
partial loss of lower limb movements. Although many events aspects that lead to the
disease development are unclear, the host's immune response, especially the cellular
response triggered by specific CD8+ T cells, is recognized as a crucial event. The
objective of this work is to investigate molecular markers in the virus and in the host
that may be related to the manifestation of the disease, mainly HAM/TSP. In Chapter
I we have search for viral markers, with regard to the differential epitope presentation,
for the different clinical profiles. We carried out a survey (Genbank) of 46 HTLV-1
complete genomes, and separated the coding regions of Tax, HBZ, p12, gp21 and
gp46 proteins. Such gene regions were evaluated for the presence of SNPs (Single
Nucleotide Polymorphism), and then translated. These molecular variations were
represented in AA sequences that were submitted to the IEDB (Immune Epitope
Database Analysis Resource) to predict linear epitopes linking HLA-I molecules. It was
possible to identify 7 “protein alleles” for the gp21 protein, 23 for gp46, 20 for HBZ, 13
for the Tax protein, and 15 for the p12 protein, all distributed among individuals ASS,
fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Sporadic) and ATLL. In prediction results, more
than 15,741 epitopes were identified for p12, the lowest amount of predicted epitopes
and more than 50,000 for Tax, with the highest amount of predicted epitopes. The p12
protein had the highest proportion of specific epitopes, also followed by the Tax protein.
The HBZ protein had the lowest percentages in all specificity ranges. The results found
for structural proteins gp46 and gp21 were similar. There was no specificity/exclusivity
of HLA alleles among proteins, "protein alleles" and/or host clinical profiles. Each
protein presented an HLA allele as being the most frequent among the “protein alleles”,
with no similarity in this occurrence. Finally, the HLA * A 32:01 allele was cited as the
most frequent in all proteins, and the gp21 and HBZ proteins showed similar profiles
with regard to the occurrence of the most frequent HLA alleles. The HAM/TSP clinical
profile showed the highest number of molecular variations among the studied proteins:
there were 42 “protein alleles” against 19 of individuals with ATLL and 16 of ASS
individuals (Non-HAM/TSP). The affinity findings revealed that 9 epitopes showed
differences in affinity to HLA molecules, 6 of them were associated with ATLL
individuals, 4 with sHAM/TSP individuals and 2 with ASS individuals. We conclude that
there is no epitope presentation profile that is associated with the host clinical status,
since there was great similarity in the HLA alleles and in the predicted epitopes
positions among the “protein alleles”. However, we have identified important molecular
variations in the epitopes prediction, especially in the genomes of individuals with ATLL
and HAM/TSP. In Chapter II, we looked for markers in the host, in a group of infected
individuals (HAM/TSP and asymptomatic) (N = 44). For this, we have performed the
determination of Exoma through the Illumina Platform and using a chip for 551,004
SNPs. The overall samples genotyping rate was 0.997001, with a loss of 35,163 SNPs
(~ 6%), identified 515,841 variants. The ancestral determination revealed a
proportionality of genetic contribution more marked for the African origin in the studied
population. We observed a predominance of women in the case group, as has already
been documented in the literature. The average age of infected individuals was 59
years (27-89 years), with an average proviral load of 55,253.41/106 cells. Among the
SNPs identified, four of them stood out regarding the allele frequencies in the case and
control groups, and they are: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C and
rs376863_A. After multivariate regression analysis, adjusted for ancestry, only the
SNPs “rs1265564” (p = 7.2 * 10-4
) and “rs376863” (p = 1.25 * 10-3
) are associated with
the outcome. The SNP rs1265564, was identified in the gene that codes for the CUX2 protein that is associated with the repair of oxidized DNA by the action of reactive
oxygen species produced in neurons. The initial four SNPs show to be in linkage
disequilibrium with other SNPs, but none of those already described in the literature
and cited in this work. We suggest a thorough search for the SNPs indicated in this
work, as well as the association of host molecular markers with viral markers, as a way
of understanding the process of infection and disease manifestation as a result of a
complex and successful integration.
