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Title: Anticorpos monoclonais para o vírus da artrite-encefalite caprina
Authors: Brandão, Camila Fonseca Lopes
???metadata.dc.contributor.advisor???: Sardi, Silva Inês
???metadata.dc.contributor.advisor-co???: Campos, Gúbio Soares
Keywords: CAEV;Anticorpos Monoclonais;Agentes Desnaturantes;Imunofluorescência Indireta;Diagnóstico Precoce
Issue Date: 17-May-2019
Abstract: O CAEV, membro da família Retroviridae, gênero Lentivirus, causa doença progressiva e debilitante em caprinos. É um vírus envelopado cujo genoma codifica a poliproteina precursora p55gag que, após clivagem proteolítica, gera as proteínas do core. Este último é formado por uma tripla camada protéica, dentro da qual se encontra a p28, proteína de maior número de unidades repetidas e com importante papel na produção de resposta imune. Na infecção, a resposta de anticorpos é lenta e em alguns casos a soroconversão pode ocorrer após vários meses. O teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) para a detecção de anticorpos possui uma baixa sensibilidade, principalmente nos estágios iniciais da infecção, o que tem estimulado a busca por técnicas mais sensíveis e que possam detectar precocemente a infecção. Muitas técnicas sorológicas utilizam Anticorpos Monoclonais (AcM), com especificidade única e que consistem em ferramentas de grande uso para fins diagnósticos ou de pesquisa para agentes virais. Neste trabalho, foram produzidos e caracterizados AcM para o CAEV com potencial aplicação no estudo e diagnóstico. Dentre as características imunológicas, foi demonstrado que todas as imunoglobulinas foram do tipo IgG1, de cadeia leve κ, sem atividade precipitante segundo o IDGA, o que evidencia a sua monovalência. Segundo a técnica de Western-blot, a atividade destes AcM está direcionada para a proteína da cápside (p28) de CAEV, contra o precursor p55gag e os produtos intermediários da clivagem, p44, p36 e p22. O sítio de ligação dos AcM na p28 é um epítopo linear ou contínuo e sem pontes dissulfeto intramoleculares e nas 17 proteínas precursoras da cápside (p55gag, p36 e p22), o epítopo está associado em proteínas diméricas ou que apresentam regiões com pontes dissulfeto, provavelmente ricas em resíduos Cys. A monoespecificidade da detecção da proteína viral foi observada usando células de Membrana Sinovial Caprina (MSC) infectadas, através da Imunofluorescência Indireta (IFI), onde todos os AcM tiveram sinal detectável para o vírus. Os AcM tiveram baixos títulos no Elisa Indireto, e os resultados foram melhorados na técnica de Dot-Blot, onde cinco AcM (G7, B9, A9, H9 e C7) detectaram o CAEV numa concentração proteica igual a 2,675 g, enquanto que o AcM F12 detectou apenas 5,35 g. Ao combinar os AcM na técnica de ELISA Combinado, observou-se uma melhor detecção do CAEV e desta forma, pode-se sugerir o uso combinado de alguns AcM, tais como o AcM A9 com o G7, C7 e o F12. A especificidade demonstrada pelos AcM para reconhecimento antigênico em ensaios imunoenzimaticos, principalmente quando enfrentados com proteínas virais e proteínas celulares, como no caso da IFI, permitiu o desenvolvimento de um processo de detecção de antígeno do Vírus da Artrite-Encefalite Caprina (CAEV) em células do leite de cabras infectadas. Estes resultados levaram a um pedido de patente.
Caprine arthritis-encephalitis virus (CAEV), a member of the Lentivirus genus in the Retroviridae family, causes progressive and debilitating diseases in dairy goats. CAEV is an enveloped virus, and its genome encodes the polycistronic precursor protein p55gag. Proteolytic cleavage of p55gag generates viral core proteins. The core proteins consist of a triple layer that includes p28, which is a major core protein containing the highest number of repeating units and plays an important role in developing the immune response. During primary infection, development of neutralizing antibody responses is slow and, in some cases, seroconversion may occur several months after infection. The agar gel immunodiffusion (AGID) test for antibody detection has low sensitivity, especially in the early stages of infection; this has prompted the search for high-sensitive techniques that may be useful for early detection of infection. Many serological techniques use highly specific monoclonal antibodies (MAbs), which are very useful diagnostic tools for infectious diseases, as well as for research on viral agents. In this study, MAbs against CAEV were produced and characterized, and their potential applications in research and diagnosis were examined. The immunological characteristics of MAbs examined by AGID revealed that they were IgG1 immunoglobulins containing κ-type light chains, with no precipitation activity detected; this finding highlights their monovalency. Western blot analysis showed that MAbs that were directed against the capsid protein (p28) of CAEV were also reactive against the p55gag precursor and the intermediate products of proteolytic cleavage (p44, p36, 19 and p22). The binding site of MAbs in p28 was found to be a linear or continuous epitope with no intramolecular disulfide bonds, whereas that in the capsid protein precursor p55gag or the intermediate proteins p36 and p22 was found to be associated with proteins that are dimeric or that contain disulfide bonds, which are probably rich in Cys residues. Monospecificity in the detection of viral proteins of CAEV was observed using infected goat synovial membrane cells, by indirect immunofluorescence (IIF), wherein all MAbs could detect the virus. Low titers of MAbs were detected using the indirect ELISA, and the results but were improved using the dot-blot method, where five MAbs (G7, B9, A9, H9 and C7) showed signal up to or equal to 2,675 g protein, while the MAb F12 detected only 5,35 g of protein. By using a combination of MAbs in the combined ELISA method, a higher detection rate of CAEV was achieved, and thus, the use of a combination of some MAbs such as the A9 MAb with G7, C7, and F12 MAbs is suggested. The specificity exhibited by MAbs for antigen recognition in immunoenzymatic assays, particularly when reacted with viral proteins or cell proteins as in the case of IIF, enables detection of the CAEV antigen in the secretory cells of infected goats. This finding has led to a patent application.
URI: http://repositorio.ufba.br/ri/handle/ri/29534
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