Efeitos imunomodulatórios do extrato de Allium cepa L. e da quercetina sobre a produção de mediadores inflamatórios e a osteoclastogênese in vitro

Abstract

Introdução: A periodontite é uma doença inflamatória que afeta a inserção do tecido conjuntivo e do osso de suporte que rodeia os dentes. Os osteoclastos estão implicados na homeostasia do tecido ósseo em situações patológicas, como na doença periodontal. O desequilíbrio na remodelação óssea pela indução de inflamação e perda óssea mediada pelos osteoclastos pode ser desencadeado pelo LPS de P. gingivalis (PgLPS). Alguns fatores e fármacos podem restaurar a homeostase do osso, com a regulação de mediadores inflamatórios como o extrato metanólico de Allium cepa L. (AcE) e a quercetina (Qt), que têm demonstrado possuir propriedades anti-inflamatórias. Objetivos: Nossos objetivos foram analisar os efeitos imunomoduladores in vitro do AcE e da Qt na osteoclastogênese em condições inflamatórias (PgLPS-induzida). Métodos: Células precursoras de osteoclastos (RAW 264.7) foram diferenciadas com 30 ng/mL de RANKL, coestimuladas com PgLPS (1 μg/mL) e tratadas com AcE (50-1000 μg/mL) ou Qt (1,25, 2,5 ou 5 μM). Ensaios de redução da resazurina e ensaio para mensuração de proteína total foram utilizados para avaliar a viabilidade celular. Ensaio de fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) foi utilizado para determinar a quantidade de p-nitrofenol libertado; e coloração de TRAP foi utilizada para avaliar o número e o tamanho dos osteoclastos multinucleados. Os níveis de citocinas foram quantificados por ELISA em sobrenadantes de cultura celular. Utilizando-se ensaios de Western blot, foi avaliada a fosforilação e a degradação do IκBα. Resultados: Foram determinadas concentrações não citotóxicas de AcE e de Qt em culturas celulares. A osteoclastogênese foi modulada negativamente nas concentrações testadas de AcE e de Qt em comparação com o controle. Todas as concentrações de AcE e de Qt diminuíram significativamente o número de osteoclastos grandes, presumivelmente mais ativos, e as concentrações de AcE a 1000 μg/mL μM reduziram o número de osteoclastos pequenos. Observou-se um decréscimo da produção de IL-6 e IL-1α e um aumento da produção de IL-3 e IL-4. Além disso, tanto o AcE quanto a Qt regularam negativamente a via do NF-κB. Conclusão: Esses resultados sugerem que o AcE e a Qt podem ser inibidores de osteoclastogênese em condições inflamatórias, por meio da diminuição da ativação da via do NF-κB induzida por PgLPS e RANKL. Mais estudos são necessários para apoiar o uso do AcE e da Qt para tratar doenças que envolvam perda óssea patológica, incluindo-se a periodontite.

Introduction: Periodontitis is an inflammatory disease that affects connective tissue attachment and the supporting bone that surrounds the teeth. Osteoclasts are implicated in normal bone remodeling and bone loss. P. gingivalis LPS (PgLPS) can cause an imbalance in the remodeling by inducing inflammation and osteoclast-mediated bone loss. Allium cepa L. (AcE) and quercetin (Qt) have been shown to possess anti-inflammatory properties. Objectives: Our aims were to examine the in vitro modulatory effects of AcE and Qt on osteoclastogenesis under inflammatory conditions (LPS-induced). Methods: RAW 264.7 cells were differentiated with 30ng/mL of RANKL, co-stimulated with PgLPS (1μg/mL) and treated with AcE (50-1000 μg/mL) or Qt (1.25, 2.5 or 5 μM). Resazurin reduction and total protein content assays were used to detect cell viability. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) assays were used to determine the amount of released p-nitrophenol that indicates the degree of differentiation in RANKL-stimulated cells; and TRAP staining was used to evaluate the number and size of TRAP-positive multinucleated osteoclast cells. Cytokine levels were measured using ELISA on osteoclast precursor cell culture supernatants. Using western blot analysis IκBα phosphorylation and IκBα degradation were evaluated. Results: Both AcE and Qt did not affect cell viability. Osteoclastogenesis was significantly affected by AcE and Qt when compared to control. Small (less active) osteoclast counts were decreased by AcE (1000 μg/mL) and Qt (2.5 and 5 μM), while all concentrations of AcE and Qt significantly decreased the number of large and presumably active osteoclasts. We observed lower production of IL-6 and IL-1α and an increased production of IL-3 and IL-4. Also both AcE and Qt downregulated NF-κB pathway. Conclusion: These findings suggest that AcE and Qt may be inhibitors of osteoclastogenesis under inflammatory conditions (LPS-induced) via attenuation of RANKL/ PgLPS-induced NF-κB activation. Further studies are needed in other to support the use of AcE and Qt to treat diseases involving pathological bone loss including periodontitis.