Produção de citocinas e expressão de mRNA por células m ononucleares de sangue periférico sob estímulo de rHmuY de Porphyromonas gingivalis na periodontite crônica

Abstract

A periodontite é uma doença multifatorial, com participação significativa do hospedeiro, fatores ambientais e bacterianos. Sua fase inicial é resultante de uma microbiota multiespécie sinérgica e disbiótica, onde patógenos conhecidos como patógenos-chave possuem efeitos em toda comunidade e são componentes críticos no desenvolvimento do processo disbiótico. Nesta categoria encontra-se Porphyromonas gingivalis, um bacilo gram-negativo anaeróbico, associado as formas crônicas generalizadas da doença. A resposta do hospedeiro durante a periodontite é complexa, com elementos da imunidade inata e adaptativa que levam à inflamação crônica e destruição progressiva dos tecidos periodontais de suporte. O presente estudo objetivou avaliar a produção de citocinas e o perfil de expressão gênica em cultura de Células Mononucleares de Sangue Periférico (CMSP) de indivíduos com periodontite crônica, frente à proteína recombinante HmuY (rHmuY) de Porphyromonas gingivalis. As células de 46 voluntários, 26 sem periodontite (SP) e 20 com periodontite crônica (PC), foram cultivadas in vitro na ausência de estimulação antigênica e sob estímulos de Pokeweed e de rHmuY por 48 horas. Após o cultivo celular, foi realizado o ensaio imunoenzimático ELISA para avaliar a produção das citocinas IL-1beta, IL-4, IL-10 e IL-18 por CMSP nos sobrenadantes de cultura. Ainda, foi utilizado o arranjo de PCR em tempo real customizado para avaliar a expressão de mRNA de genes relacionados à apoptose, citocinas, quimiocinas e receptores, além de proteínas de choque térmico, fatores de transcrição e inibidor de transcrição. Não foram encontradas diferenças entre os grupos SP e PC na produção de IL-4 e IL- 1beta por CMSP estimuladas com rHmuY. Níveis mais elevados de IL-18 foram significativamente induzidos por HmuY e na ausência de estimulação em células do grupo PC. Os níveis de IL-10 foram reduzidos no grupo PC nas células estimuladas com HmuY e houve uma tendência para significância estatística para níveis baixos desta citocina nas células não estimuladas do grupo PC. A expressão de mRNA para CCL2 aumentou significativamente em CMSP sob estímulo HmuY e o mRNA para NFKBIL1 diminuiu significativamente nestas células sob o mesmo estímulo no grupo PC. Entretanto, houve uma tendência para significância estatística para níveis baixos de expressão de mRNA para IL-10 e IL-18 em CMSP em PC. Em comparação com os controles SP, os pacientes do grupo PC apresentaram baixos níveis de expressão de genes relacionados a apoptose (FAS, FAS-LG, TNFSF10 (TRAIL), BAK1, CASP9 e APAF1) quando as CMSP foram estimuladas com HmuY. Ainda, as células de pacientes do grupo PC apresentaram baixos níveis de expressão do gene CASP7 quando as células não foram estimuladas. Nossos achados sugerem que HmuY de Porphyromonas gingivalis pode ter um papel importante na modulação das vias intrínseca e extrínseca de apoptose e que esta proteína estimula resposta inflamatória no hospedeiro.

Periodontitis is a multifactorial disease, with significant participation of the host, environmental factors and bacterial. Its early stage results from a synergistic and disbiotic multispecies microorganisms where known as “keystone” have effects throughout the community and are critical components in the development of disbiotic process. This category is Porphyromonas gingivalis, an anaerobic gram-negative bacilli associated chronic generalized forms of the disease. The host response during periodontitis is complex with components of the innate and adaptive immune system that lead to chronic inflammation and progressive destruction of periodontal tissue support. This study aimed to evaluate the production of cytokines and the profile of gene expression in culture of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) of patients with chronic periodontitis, under stimulation of Porphyromonas gingivalis recombinant protein HmuY (rHmuY). The cells of 46 volunteers, 26 non-periodontitis (NP) and 20 chronic periodontitis (CP) were cultured in vitro in the absence of antigenic stimulation and under Pokeweed and rHmuY stimuli for 48 hours. After cell culture, the enzyme immunoassay ELISA was conducted to evaluate the production of cytokines IL-1b, IL-4, IL-10 and IL-18 by PBMC in culture supernatants. Further, PCR was used arrangement in real time customized to evaluate the mRNA expression of apoptosis related genes, cytokines, chemokines and receptors, and heat shock proteins, transcription factors and transcription inhibitor. No differences were found between the NP and CP groups in IL-4 and IL-1beta by PBMC stimulated with rHmuY. Higher levels of IL-18 were significantly induced HmuY in the absence of stimulation in cells of CP group. IL-10 levels were reduced in CP group in cells stimulated with HmuY and there was a trend towards statistical significance for low levels of this cytokine in unstimulated cells CP group. The expression of mRNA for CCL2 increased significantly in PBMC under HmuY stimulus and the mRNA for NFKBIL1 decreased significantly in these cells under the same stimulus in the CP group. However, there was a borderline significance for low levels of mRNA expression for IL-10 and IL-18 in PBMC of CP. Compared to the NP controls, patients in the CP group had low gene expression levels related apoptosis (FAS, FAS-LG, TNFSF10 (TRAIL), BAK1, CASP9 and APAF1) when PBMC were stimulated with HmuY. Further, cells in the CP group patients showed low levels of expression of the gene CASP7 when the cells were not stimulated. Our findings suggest that HmuY of Porphyromonas gingivalis can play an important role in the modulation of intrinsic and extrinsic pathways of apoptosis and that this protein stimulates inflammatory response in the host.